运动血清调节正常大鼠肾细胞的尿酸转运蛋白

UA在肾脏疾病中起着重要作用¹．HUA是一种与SUA水平直接相关的生理状态。体内长期高水平的SUA会引起各种组织损伤和功能下降，可能诱发痛风²，肾脏损伤^3.，代谢综合征^4，5，以及其他严重影响身体健康的疾病。肾脏在体内各种物质的代谢中起着至关重要的作用，也是体内尿酸排泄的主要途径。肾脏尿酸的排泄有四个步骤:过滤、分泌前重吸收、分泌和分泌后重吸收⁶．ABCC4, ABCG2^7，8, GLUT9⁹、URAT1¹⁰在肾小管上皮细胞中有重要的作用，其功能障碍可能影响UA的排泄。

运动对身体的所有生理系统都有多重影响¹¹．由于组织和器官的适应，定期的体育活动和运动训练可增强功能能力和改善身体健康。近年来，已有研究证明，骨骼肌的收缩可以释放出多种代谢产物，如生物活性蛋白，这些代谢产物可能在有规律的运动中，对增强人体各种组织器官的功能起着重要作用^12，13．此前的研究表明，运动后血液中代谢产物的增加可以改善海马功能¹⁴增加人脂肪细胞中GLUT4的表达¹⁵．另一项研究表明，长期运动经历的人的血清也增加了海马神经元细胞的脑源性神经营养因子(BDNF)和原肌球蛋白相关激酶B (TrkB)的蛋白表达(HT-22)。¹⁶这表明运动导致循环生物活性分子的增加。

运动可以降低HUA患者的SUA水平，在健康人群中也有类似的效果¹⁷．已有研究表明，NF-κB和NRF-2可能在调节这些UA转运蛋白在人体各组织中的表达中起着重要作用，而运动对NF-κB和NRF-2的影响也得到了证实^12，13．然而，运动减少SUA的原因还不清楚。本研究旨在探讨运动大鼠血清是否影响正常大鼠肾细胞通过ABCC4、ABCG2、URAT1、GLUT9转运UA的能力及生理机制。

动物和细胞

该研究获得了北京体育大学体育科学实验伦理委员会(ID 2020175A)的批准。据报道，该研究遵循了arrival指南。所有有关实验动物处理和使用的程序都是按照欧盟(UE)关于保护用于科学研究的动物的指令2010/63/EU的规定执行的。实验是按照所谓的3Rs原则进行的(替换，还原，提纯动物)。

选用健康雄性SD大鼠20只(8周龄，体重229.788±16.609 g)，购自思培福(北京)生物技术有限公司(SCXK2019-0010)。所有大鼠按Excel生成的随机数表编号，随机分为对照组(CON, n = 10)和运动组(EXE, n = 10)，体重分别为230.742±13.836和228.834±19.727 g(平均±SD)。NRK-52E细胞购自武汉Procell生命科学技术有限公司(Procell, CL-0174)。

大鼠运动计划

运动干预前，EXE组大鼠适应跑步机运动3 d。适应跑步机后，每只大鼠在坡度和VO为5°的跑步机上进行分级运动测试₂max使用哥伦布Oxymax系统(哥伦布仪器，美国)进行测试。当大鼠被电击后不奔跑时，或当结果为VO时₂连续两次下降，则认为该鼠已达到VO₂最大强度。在这6周内，VO₂max每两周检测一次，根据VO调整运动强度₂最大的结果。EXE组在跑步机上以50% VO热身10分钟₂运动前最大强度。热身后，EXE组以70% VO进行50分钟的有氧运动₂最大强度(坡度:5°)。运动干预为期6周，每周6天。

样品收集

末次运动后24h，大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯溶液(5 ml/kg)麻醉。从大鼠腹主动脉取血置于真空血管中，离心取血清。采集大鼠的肾脏和肝脏，所有样本保存在- 80°C备用。

细胞培养

细胞培养前，将同组大鼠血清充分混合。NRK-52E细胞分为对照组(CON)、运动血清组(EXE)和运动血清与ML385组(EXE + ML)在DMEM + 10%FBS + 1%(青霉素-链霉素溶液)的6孔板中培养。待细胞生长至约80%融合后，无血清暴露24小时，然后在不同的新培养基中暴露24小时(37°C, 5% CO₂饱和湿度)进行进一步测试。CON组的培养液含有10%的CON大鼠血清，EXE组的培养液含有10%的EXE大鼠血清，EXE + ML组的培养液含有10%的EXE大鼠血清，并添加高效NRF-2抑制剂ML385 (5 μmol/L)¹⁸．

细胞尿酸转运能力

细胞按上述方法培养24 h后，将细胞置于跨孔板上腔。上室和下室分别代表肾细胞的顶端侧和基底侧。因此，对每组细胞设置两种不同的处理方法，以验证不同处理方法对NRK-52E细胞UA排泄和UA重吸收能力的影响。1只在上腔以300 μmol/L的UA处理24 h，测定下腔UA水平，以反映不同干预方式对NRK-52E细胞UA重吸收能力的影响。另一组仅在下腔中添加300 μmol/L的UA，通过测定上腔中UA的水平来反映不同干预方法对NRK-52E细胞UA排泄能力的影响。用UA试剂盒(南京建成生物工程研究所，C-012-2)比色法测定上、下腔UA水平，以反映细胞对UA的重吸收或排泄能力。

血清尿酸

在6周运动干预前后，从所有大鼠的眶后丛中抽取血液。在3500 rpm离心15 min后获得血清。在试验条上加入血清滴液，用旺德福DC-101(广州旺德福生物科技有限公司，CHN)干化学法测定SUA。

血清和肝脏XOD

采用大鼠XOD试剂盒(武汉斯普比奥股份有限公司)，酶比色法测定血清(末次运动后24 h)和肝脏XOD水平。

总蛋白提取和Western Blot

收集肾脏和NRK-52E细胞。肝脏在预冷EP管中低温均质20 s 2 ~ 3次。冰浴30分钟后，在4℃离心30分钟(13000 rpm)提取上清。用BCA试剂盒(P0010;Beyotime)。提取的蛋白上清与5 ×蛋白负载缓冲液(按4:1体积混合)放入沸水中浸泡10分钟。变性后冷却至室温，−20℃保存。蛋白(每个通道20 μL)装入预先制备的凝胶(5%浓缩凝胶，12%分离凝胶)上，用DYY-7C电泳仪(北京六一仪器，CHN)电泳。使用CZ-40转移箱(北京六一仪器，CHN)将凝胶转移到PVDF膜上，然后用ponceau染色，然后切割印迹，然后与抗体杂交。用不同稀释比例的特异性抗体对蛋白进行免疫印迹处理(见表1)中含有5%脱脂奶粉(SMP)的TBST。然后用TBST中的第二抗体对蛋白进行处理。每个膜上只检测到一种蛋白和GAPDH。使用BandScan分析灰度值。

统计分析

所有大鼠SUA及NRK-52E细胞中UA转运体蛋白表达均以Mean±SD表示。采用SPSS19.0对所得数据进行Kolmogorov-Smirnov检验，所有数据均符合正态分布。组间比较采用SPSS 19.0独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验，p< 0.05，p< 0.01为统计学差异。

XOD和SUA水平

运动6周后，CON和EXE之间血清和肝脏XOD水平无显著差异(表2)2和无花果。1B). EXE组的SUA低于CON组(p< 0.05;表格3.和无花果。1一个)。

NRK-52E细胞的尿酸排泄和重吸收能力

细胞的上腔UA水平在EXE组高于CON组(p< 0.05;表格4和无花果。1C)， EXE + ML组细胞上腔UA水平低于EXE组(p< 0.05;表格4和无花果。1C). EXE + ML组细胞下腔UA水平低于EXE组(p< 0.01;表格4和无花果。1D)。

NF-κB和NRF-2蛋白表达

运动6周后，EXE组大鼠的NRF-2表达高于CON组，但CON组和EXE组大鼠的NRF-2表达无明显差异(表2)5和无花果。2A1, B1)。EXE组肾脏NF-κB表达明显低于CON组(p< 0.01;表格5和无花果。2A1, C1)。

将NRK-52E细胞暴露于6周运动24小时后获得的10%血清中，平均增加了21.0%的NRF-2蛋白表达(p< 0.01;表格6和无花果。2A2, B2)，与暴露于10%血清的不运动大鼠相比。将NRK-52E细胞暴露于含有ML385的运动6周24小时后获得的10%血清中，NRF-2蛋白表达降低(p< 0.01;表格6和无花果。2A2, B2)，与暴露于运动后获得的10%血清但没有ML385相比。

将NRK-52E细胞暴露于运动6周24小时后获得的10%血清中，NF-κB蛋白表达平均降低44.2% (p< 0.01;表格6和无花果。2A2, C2)，与未运动获得的10%血清暴露相比。将NRK-52E细胞暴露于含有ML385的6周运动24小时后获得的10%血清中，NF-κB蛋白表达增加(p< 0.05;表格6和无花果。2A2, C2)，与暴露于运动后但无ML385的10%血清相比。

ABCC4和ABCG2蛋白表达

运动6周后，EXE组肾脏中ABCC4的表达明显高于CON组(p< 0.05;表格7和无花果。3.A1, B1)。EXE组肾脏中ABCG2的表达明显低于CON组(p< 0.05;表格7和无花果。3.A1, C1)。

将NRK-52E细胞暴露于运动6周24小时后获得的10%血清中，ABCC4蛋白表达平均增加92.7% (p< 0.01;表格8和无花果。3.A2, B2)， ABCG2蛋白表达平均降低28.9% (p< 0.01;表格8和无花果。3.A2、C2)。将NRK-52E细胞暴露于含ML385运动6周24小时后获得的10%血清中，ABCC4蛋白表达降低(p< 0.01;表格8和无花果。3.A2, B2)与运动后获得的10%血清相比，但没有ML385。

URAT1和GLUT9蛋白表达

运动6周后，EXE组肾脏中URAT1的表达明显高于CON组(1.691±0.614 vs. 1.000±0.442 a.u。p< 0.05;表格9和无花果。4A1, B1)。EXE组肾脏中GLUT9的表达明显高于CON组(1.338±0.242 vs. 1.000±0.173 a.u.);p< 0.05;表格9和无花果。4A1, C1)。

将NRK-5he2E细胞暴露于运动6周24小时后获得的10%血清中，URAT1蛋白表达平均增加了126.2%(2.262±0.441 vs. 1.000±0.531 a.u)。p< 0.01;表格10和无花果。4A2, B2)，与未运动获得的10%血清暴露相比。将NRK-52E细胞暴露于含有ML385的6周运动24小时后获得的10%血清中，URAT1蛋白表达降低(1.337±0.494 vs. 2.262±0.441 a.u。p< 0.01;表格10和无花果。4A2, B2)，与暴露于运动后获得的10%血清但没有ML385相比。

NRK-52E细胞暴露于运动6周24小时后获得的10%血清中，GLUT9蛋白表达平均增加了126.0%(2.260±0.409 vs 1.000±0.550 a.u)。p< 0.01;表格10和无花果。4A2, C2)，与未运动获得的10%血清暴露相比。将NRK-52E细胞暴露于含有ML385的6周运动24小时后获得的10%血清中，GLUT9蛋白表达降低(1.212±0.595 vs. 2.260±0.409 a.u)。p< 0.01;表格10和无花果。4A2, C2)，与暴露于运动后但无ML385的10%血清相比。

在嘌呤代谢的下游途径中，XOD不仅催化了次黄嘌呤从中间体到黄嘌呤再到UA的代谢，而且直接催化了黄嘌呤从中间体到UA的合成，是生成UA的关键限速酶。XOD活性增加是HUA发生的主要原因之一¹⁹．我们的研究显示，有氧运动6周后，大鼠肝脏XOD活性无显著差异，说明有氧运动6周对大鼠UA的产生没有影响。有氧运动6周后，大鼠SUA水平明显低于对照组。

细胞在transwell板中培养时，上室和下室分别代表肾脏细胞的顶端侧和基底侧。因此，下腔的UA转运到上腔取决于细胞的UA排泄功能。相比之下，上腔的尿酸向下腔的转运依赖于细胞的尿酸重吸收功能。长期运动后的血液循环因子在血清暴露24小时后增加了NRK-52E细胞上腔UA水平。当抑制NRF-2时，上腔UA水平降低。这些结果提示，大鼠SUA的减少与肾脏UA排泄量的增加有关，细胞中UA转运体的功能可能与NRF-2的功能有关。

NF-κB和NRF-2在调节炎症反应中发挥重要作用^20.，21还有氧化应激²²．另外，一些UA转运蛋白的功能受NF-κB和NRF-2的调控^23，24，25．提示NF-κB和NRF-2在HUA的发病机制和临床病理表型中发挥重要作用。长期规律的有氧运动还可以通过调节肾脏中NF-κB和NRF-2的表达来提高机体的抗氧化能力²⁶，减弱氧化应激损伤，减少炎症反应，减轻肾脏损伤，改善肾功能^27，28．在本研究中，有氧运动6周后，EXE组大鼠NF-κB表达明显低于CON组，虽然在EXE组和CON组大鼠之间NRF-2表达无显著差异，但EXE组大部分个体的NRF-2表达水平高于CON组。长期运动后，血清暴露24 h后，NRK-52E细胞中循环因子表达增加，NF-κB表达降低。以上结果提示，6周的有氧运动可以提高肾脏和细胞的抗氧化能力，抑制炎症反应，保护肾脏。

ABCC4 (MRP4)是肾细胞排泄UA的重要途径²⁹．它通过上皮细胞消耗ATP将UA排入小管，使UA随尿液排出^30.．当ABCC4的表达被抑制时，肾脏对UA的排泄减少，这是HUA和痛风的风险³¹．ABCG2通过消耗ATP调节肾小管上皮细胞前膜UA的分泌^32，33．当ABCG2蛋白表达增加时，UA的排泄量增加^34，35证实了ABCG2在肾脏UA排泄中起着至关重要的作用，而ABCG2的功能变化也与HUA发生的风险密切相关³⁶．

ABCC4和ABCG2在肾脏中具有排泄UA的功能，是各种抗癌药物和环境致癌物在各器官运输的底物^37，38．因此，目前的研究主要集中在不同药物或环境对ABCC4和ABCG2功能的影响，相关研究表明具有抗氧化作用的药物可能通过调节NRF-2和NF-κB的表达来提高ABCC4和ABCG2的表达²⁴．有氧运动也具有抗氧化作用，已证实其对人体各组织器官NRF-2表达的积极作用，提示长期有氧运动后血清循环因子可能通过NRF-2途径对ABCC4和ABCG2表达有积极作用^39，40．然而，很少有研究关注运动对ABCC4和ABCG2表达的影响。只有一篇论文报道了在一段时间的跑步机运动后，大鼠海马中ABCG2的表达增加⁴¹，运动对肾脏中ABCC4和ABCG2表达的影响尚未见报道。

我们的结果表明，有氧运动增加了健康大鼠肾脏中ABCC4的表达，长期运动后的血液循环因子增加了血清暴露24 h后NRK-52E细胞中ABCC4的表达。这一结果提示运动后肾脏中UA转运体的表达变化与血液循环因子有关。而当NRF-2在细胞内被抑制时，ABCC4的表达下降。以上结果提示，长期运动后血清循环因子可显著提高肾小管上皮通过ABCC4排泄UA的能力，且ABCC4的表达与NRF-2的表达呈正相关。这一现象与以往研究中其他组织中蛋白质的变化趋势相同^39，42，这与我们研究的假设相同。但在本研究中，有氧运动6周后，大鼠肾脏中ABCG2的表达下降，血清暴露24 h后，NRK-52E细胞中ABCG2的表达下降。当NRF-2被抑制时，NF-κB和ABCG2的表达增加，提示长期运动可能削弱肾小管上皮通过ABCG2排泄UA的能力。虽然ABCG2和NF-κB的相同趋势与我们的假设和之前的研究一致，但运动后血清暴露细胞中ABCG2的下降与我们的假设完全相反。我们的研究发现，NF-κB和NRF-2的变化相反。以上结果提示，有氧运动不能同时激活NF-κB和NRF-2的表达。ABCG2抑制的主要原因可能与运动后NF-κB表达降低有关。ML385抑制NRF-2后，NRK-52E细胞(EXE + ML组)NF-κB和ABCG2表达增加，也证实了上述观点。

有研究表明，ABCG2的表达取决于细胞内UA的水平⁴³，因此推测血清暴露后ABCG2表达降低可能与培养基中低浓度的UA有关。因此，需要进一步研究这些现象的原因。

URAT1是一种表达于肾皮质近曲小管刷缘的UA转运蛋白，可在近曲小管约一半处重吸收UA⁴⁴．一项相关研究表明，敲除URAT1可降低小鼠肾脏UA的重吸收功能，证实了URAT1对UA的重吸收作用¹⁰．我们的结果表明，有氧运动增加了健康大鼠肾脏中URAT1的表达，长期运动后的血液循环因子增加了血清暴露24 h后NRK-52E细胞中URAT1的表达。当NRF-2被抑制时，URAT1的表达下降。这一结果表明，URAT1的表达与NRF2呈正相关，长期运动后血清循环因子可能显著提高肾小管上皮通过URAT1吸收UA的能力。然而，URAT1的表达增加与我们的研究假设不一致，长期有氧运动通过增加UA的排泄和减少UA通过肾小管上皮的重吸收来减少SUA。相关研究表明，UA在体内是一种抗氧化剂，SUA水平的平衡对维持机体的抗氧化能力至关重要⁴⁵．在本研究中，有氧运动6周后，血液循环因子导致肾脏和细胞中URAT1表达升高，可能是一种保护机制，以防止其他UA转运蛋白的升高导致UA过量排出。研究表明，HUA个体的URAT1表达高于健康个体^46，47．健康大鼠运动后URAT1蛋白活性增加⁶该研究提出，运动诱导的URAT1表达和活性的变化与血尿酸水平升高有关。然而，我们的研究结果表明，运动后URAT1表达的变化并不仅仅与SUA水平有关。此外，除了HUA外，URAT1的表达也与低尿酸血症相关⁴⁸．本研究中细胞URAT1表达的增加可能与低UA环境有关，因此推测本研究中血清暴露后URAT1表达的增加可能与培养基中低UA浓度有关。然而，这一现象的原因还需要进一步的实验来探索。

GLUT9主要在肝脏和肾脏中表达^{49，50，51，52}．虽然被命名为葡萄糖转运蛋白9，但GLUT9的主要转运能力体现在UA的转运上，而不是葡萄糖⁹．一项相关研究表明，当GLUT9表达减少时，体内SUA水平降低⁴⁶证实了GLUT9对UA的重吸收作用⁴⁸．我们的结果表明，有氧运动增加了健康大鼠肾脏中GLUT9的表达，长期运动后的血液循环因子增加了血清暴露24 h后NRK-52E细胞中GLUT9的表达。当NRF-2被抑制时，GLUT9的表达下降。这一结果表明，GLUT9的表达也与NRF2呈正相关，长期运动后血清中循环因子可能大大提高肾小管上皮通过GLUT9重新吸收UA的能力。

综上所述，长期有氧运动后血液循环因子在调节肾脏UA转运蛋白表达中起重要作用，血液循环因子通过调节NRF-2调节ABCC4、URAT1、GLUT9，通过调节NF-κB调节ABCG2。目前尚不清楚运动后血清中哪种循环因子的变化最终会影响NRF-2和NF-κB。我们的研究结果表明，长期有氧运动可以促进肾脏UA的排泄能力，降低健康机体SUA水平，提示有氧运动可能是预防HUA的一种手段。为今后研究运动预防HUA的生理机制提供了理论依据。