简介

链霉菌属spp．革兰氏阳性，孢子形成细菌，在几乎所有的土壤环境中茁壮成长。它们以生产各种临床相关抗生素的能力而闻名，如链霉素、新霉素、氯霉素等1，2，3.．大多数研究集中在这些细菌的工业应用及其次生代谢产物的分泌4，5．然而，噬菌体如何识别、附着和感染这些多细胞细菌在很大程度上仍然未知。链霉菌属有一个不寻常的生命周期，当孢子遇到有利的环境时就开始了。这就触发了种子的萌发和生长，形成所谓的营养菌丝体。经过一段时间的营养生长，形成气生菌丝，可以发展成孢子链。这些孢子可以分散到更有利的环境中建立新的菌落。之前的研究表明链霉菌属噬菌体只能感染年轻的营养菌丝，但不能感染孢子6，7．然而，大多数噬菌体的研究都集中在单细胞细菌上，而噬菌体感染多细胞细菌的相互作用和潜在机制，如链霉菌属,大部分未被探索。除了噬菌体生长限制系统8，9化学防御10最近发现了细胞壁缺陷11，可能存在更多对抗噬菌体攻击的防御机制链霉菌属．此外，相对较少链霉菌属与其他属相比，噬菌体已被正确地测序和表征。因此，分离感染多细胞细菌物种的新噬菌体非常重要，这使我们能够扩大对巨大的病毒多样性的认识。

在本文中，我们描述了一种新发现的放线菌噬菌体，称为链霉菌属这种噬菌体是从荷兰的土壤样本中分离出来的。这种噬菌体属于噬菌体属Janusvirus，在亚科内Arquattrovirinae．Pablito噬菌体是一种温带噬菌体，其二十面体衣壳头为56.1±1.3 nm，长尾为163.5±0.4 nm。最后，我们提供了这个新发现的噬菌体的全基因组分析。这些结果为噬菌体分类学的研究提供了新的思路，拓宽了噬菌体的研究领域链霉菌属未来的互动。

材料与方法

噬菌体分离

Phage Pablito是从荷兰Zuid-Kennemerland国家公园(N52°23′31″，E4°34′49″)的土壤样本中分离出来的。为此，将0.5 g土壤与来自宿主的孢子混合美国lividans菌株1326在10ml Difco营养肉汤(DNB) (BD Biosciences)中添加0.5%葡萄糖和4 mM Ca(NO3.）2在30°C下孵育过夜，同时以130转/分钟的速度摇晃。24 h后，4000 g离心10 min，含噬菌体的上清液通过0.22µm过滤器(Millipore)过滤。随后将上清液涂抹在DNB琼脂板上，然后涂抹含有10的DNB软琼脂覆盖层3.孢子毫升−1从美国lividans．在30°C下孵育24-48小时，然后评估斑块形成情况。将单个斑块划两次到含有细菌宿主的新鲜双琼脂覆盖板上，对其进行纯化。高滴度的单一病毒原液是通过挑选纯化的空斑和孵育美国lividans在双琼脂覆盖DNB板前，在DNB培养基中浸泡10分钟。用24ml DNB淹没平板，轻轻摇动平板2小时，收集病毒裂解物。上清液通过0.22 μ m过滤器过滤。收集的噬菌体保存在4°C。

主机范围分析

在双琼脂覆盖板上连续稀释，确定噬菌体Pablito的宿主范围。简而言之，3 μ l的噬菌体稀释剂在不同的细菌草坪上被发现重复链霉菌属而且Kitasatospora来自莱顿大学微生物生物技术(MBT)收藏的菌株12，代表内部收集的分离放线菌。在观察裂解前，将平板在30°C孵育至少24小时。裂解区的存在被评分为阳性结果。计算给定应变相对于宿主应变的电镀效率(EOP)美国lividans观察到斑块时。

噬菌体的稳定性

在3个重复中进行单步生长曲线分析，计算潜伏期和噬菌体爆发大小13．简而言之，105孢子毫升−1的美国lividans在10 ml DNB培养基中，30°C孵育5小时T= 0时，在感染多重度(MOI) = 0.01时，用噬菌体Pablito感染培养物，每隔10分钟至180分钟采样100µl。样品过滤、稀释并立即镀于双琼脂板上。爆破大小按以下公式计算:

$ ${\文本{破裂}}\;{\文本{大小}}= \压裂{{{文本\{平均}}\;文本的{}}{\ \;文本自由}{}{\ \;文本{噬菌体}}{\ \;{\文本后{}}\;{\文本{破裂}}\离开({{\文本{T}} = 90 \;文本{}}{\ \;{\文本{T}} = 180} \右)——文本{平均}}{\ \;文本的{}}{\ \;文本自由}{}{\ \;文本{噬菌体}}{\ \;{\文本之前{}}\;{\文本{破裂}}\;\离开({{\文本{T}} = 10 \;文本{}}{\ \;{\文本{T}} = 80} \右)}}{{{{号码}\文本}\;文本的{}}{\ \;文本{噬菌体}}{\ \;{\文本在}{}\;T = 0}} $ $

噬菌体Pablito的热稳定性是通过培养1毫升裂解液(106空斑形成单位毫升−1)在25、30、37、45、55和65°C。培养1 h后过滤样品，立即在双琼脂板上镀膜以测定噬菌体滴度。pH稳定，10 μ l噬菌体Pablito悬液(106噬菌体毫升−1)加入990 μ l DNB培养基中，用6 M HCl或1 M NaOH调整到不同的pH值(2-9)。然后在30°C下孵育管1 h，然后通过0.22µm过滤器过滤样品，并使用双琼脂覆盖法进行镀膜。所有测量一式三份。

DNA提取和系统发育分析

使用Norgen公司(Thorold, Canada)生产的噬菌体DNA分离试剂盒，按照制造商的方案分离Pablito噬菌体DNA。分离后，将多个样本汇集在一起，使用Concentrator Plus (Eppendorf)对DNA进行浓缩20分钟。使用Illumina NovaSeq PE150测序，平均覆盖率为118.21(荷兰莱顿)，BaseClear对噬菌体Pablito进行全基因组测序和从头组装。完整的基因组序列链霉菌属噬菌体Pablito存放在GenBank，登记号OK412919。利用geneous Prime 2020.1.2构建基因组线性图谱，利用PhageTerm确定基因组末端14．

系统发育分析使用假定的蛋白质序列的主要衣壳头蛋白。蛋白质序列链霉菌属噬菌体Janus, Hank144, Pablito和Joe从NCBI获得，并使用肌肉对齐15．利用分子进化遗传学分析版本X (MEGAX)构建了最大似然系统发生树，采用100个自举重复对噬菌体属进行了估计。

电子显微镜

两种液体培养美国lividans用5 × PEG溶液(20% PEG8000, 2.5 M NaCl)在4℃下过滤、结合、沉淀过夜，3500 g离心70 min，弃上清。剩余的颗粒中，3µl放置在发光放电的200目碳涂层铜网格(EMS)上，并让其凝固30秒，然后用滤纸去除多余的样品溶液。噬菌体用2%的乙酸铀酰染色45秒，再风干30分钟。在荷兰纳米观察中心(NeCEN，莱顿)，使用120 kV Talos L120C TEM, Lab6电子源和Ceta检测器，使用单个倾斜标本架观察网格。

结果与讨论

Pablito的形态和寄主范围的测定

噬菌体产生清晰的小斑块上美国lividans使用双琼脂覆盖法检测宿主菌株(图。1a).透射电子显微镜(TEM)显示噬菌体Pablito的形态。这表明噬菌体Pablito的衣壳头为56.1±1.3 nm (n= 3)和163.5±0.4 (n= 3)(图1b).长而灵活的尾巴和二十面体衣壳头是该噬菌体属于虹吸病毒类的第一个迹象Caudoviricites，全基因组测序进一步证实了这一点(见下文)。

图1
图1

噬菌体Pablito的形态。（一个)感染24 h后噬菌体Pablito的菌斑形态美国lividans使用DNB双琼脂覆盖板。（b)噬菌体Pablito的代表性TEM图像。用2%醋酸铀酰染色噬菌体颗粒。

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对10种放线菌进行寄主范围试验，结果显示全部8种链霉菌属所测试的菌株可能被噬菌体Pablito感染(表1)．根据不同的寄主菌株，一些裂解区呈现浑浊形态，这是常见的几种链霉菌属噬菌体16，这是首次表明噬菌体Pablito可能是温带噬菌体。一个菌株相对于宿主菌株的EOP美国lividans从中分离出噬菌体，当斑块计数时给予。相反，两个未被感染的物种(即MBT66和k . viridifaciens)属于姊妹属Kitasatospora,与放线菌形态相似的放线菌链霉菌属但一般按其抵抗程度分类链霉菌属噬菌体17，18．

表1菌斑试验测定放线菌菌株对噬菌体Pablito感染的敏感性。
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基因组分析

噬菌体Pablito的全基因组测序和从头组装显示了49,581个碱基对的双链DNA基因组。而它的宿主美国lividansG + C含量较高，为72%，链霉菌属噬菌体Pablito的G + C含量为66.4%，其3 ' -内聚末端为CGCCGTGTCTT(图2)。2)．基因组包含76个潜在编码序列(CDSs)，其中50个编码假设的蛋白质，而26个CDSs的功能可以预测。后者被分类为形态发生蛋白、核苷酸代谢和DNA复制蛋白、溶原模块和细菌裂解蛋白，如图所示。2．

图2
图2

的dsDNA基因组的示意图表示链霉菌属噬菌体的保罗罗西。箭头指向光盘的方向。假设的蛋白质以黄色显示，预测蛋白质的颜色代码如下:绿色表示核苷酸代谢和DNA复制，橙色表示形态发生，红色表示溶生，深蓝色表示细菌裂解。绿线表示AT内容，蓝线表示GC内容。基因组图是通过geneous Prime 2020 1.2生成的。

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系统发育分析(图;3.A)基于假定的主要衣壳头部蛋白揭示链霉菌属与噬菌体Pablito相似链霉菌属噬菌体Janus和链霉菌属噬菌体Hank144链霉菌属噬菌体乔是远亲。根据细菌病毒小组委员会的标准，70%的核苷酸同一性被确定为属的界限，而95%的同一性将噬菌体指定为同一物种19．由基因组间距离计算器VIRIDIC计算20.，链霉菌属与噬菌体Pablito的亲缘关系分别为70.0和72.5%链霉菌属噬菌体Janus和Hank144(图;3.b).由于链霉菌属噬菌体Pablito低于95%，根据国际病毒分类委员会(ICTV)，该噬菌体被认为是一个新物种。20.．因为链霉菌属噬菌体Janus和链霉菌属噬菌体Hank144均为温带噬菌体，全基因组测序显示其中存在丝氨酸整合酶蛋白链霉菌属我们得出结论，噬菌体Pablito也是温带噬菌体21．总之，这些数据表明链霉菌属噬菌体Pablito是新发现的一种，可归入该属Janusvirus．已向ICTV提交了一份分类提案，正式承认噬菌体Pablito属的一部分Janusvirus作为一个叫做"Janusvirus保罗罗西”。放线菌噬菌体数据库(https://phagesdb.org/)将噬菌体Pablito置于簇BD，亚簇BD2。此外，噬菌体Pablito与发现的两种噬菌体外周相关链霉菌属finlayi菌株NBSH44和链霉菌属venezuelae菌株ATCC 14583。

图3
图3

链霉菌属噬菌体属于噬菌体亚科Arquattrovirinae,属Janusvirus．（一个基于主要衣壳头蛋白的噬菌体Pablito的进化史。总共使用100个自举重复来计算MEGA.X中的最大似然树。（b)由VIRIDIC计算的热图20.显示噬菌体基因组之间的成对基因组间距离/相关性。的基因组链霉菌属噬菌体Janus (NC_054660.1)和链霉菌属用噬菌体Hank144 (NC_054661.1)进行亲缘关系分析，而噬菌体Hank144 (NC_054661.1)的基因组进行亲缘关系分析链霉菌属噬菌体Joe (NC_054674.1)被用作离群值。

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一步生长曲线

链霉菌属噬菌体对细菌的吸附是最大的16．因此我们孵化了美国lividans孢子先在DNB培养基中培养5小时，然后用噬菌体感染培养物。噬菌体Pablito的一步生长曲线显示，潜伏期较长，为80 min，每个细胞爆发大小为22个病毒粒子(图2)。4)．然而，在150分钟左右观察到病毒滴度的另一个上升，这可能发生在多个噬菌体与一个发芽孢子结合时，作为延迟吸附的标志或溶原性感染周期的指示22．最高滴度在10左右6空斑形成单位毫升−1不同的MOI范围，更长的潜伏期，甚至淹没融合的菌斑板都没有导致噬菌体总数ml的增加−1．

图4
图4

一步增长曲线。在MOI = 0.01时，噬菌体Pablito的潜伏期为80 min，第二次爆发时间为150 min，每个细胞的总爆发大小为22个病毒粒子。

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噬菌体的稳定性

我们还评估了温度和pH值对噬菌体活力的影响。噬菌体Pablito在45°C时保持稳定，活力没有降低(图。5a).但是，当噬菌体在55°C或更高温度下孵育1小时时，传染性显著降低。Phage Pablito在pH 7.0 ~ 9.0时相对稳定，pH低于6.0时感染性急剧下降(图;5b). pH低于4.0时未发现斑块，pH 5.0和pH 6.0时仅保留少量活性。

图5
图5

噬菌体的稳定性。（一个Pablito噬菌体在25 ~ 45℃的温度范围内保持相对稳定，但在更高的温度下观察到稳定性下降。（b) pH 7.0及以上时噬菌体稳定性最佳。pH≤6.0时，PFU显著下降。

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结论

这项研究提出链霉菌属噬菌体Pablito是一种温和的噬菌体，能够感染多种细菌链霉菌属菌株。基因组分析和TEM图像表明，该噬菌体可归为该属的一个新种Janusvirus在亚科内Arquattrovirinae．这个亚科/属的成员有长而不收缩的尾巴和二十面体的衣壳头。帕布利托噬菌体显示出每个细胞22个病毒粒子的爆发大小，在25至45℃的温度和7.0至9.0的pH值范围内稳定。该噬菌体可用于未来的研究，以揭示新的噬菌体-链霉菌属相互作用，揭示噬菌体如何影响土壤群落。