筛选和鉴定为阴道微生物群移植阴道分泌物的捐款gydF4y2Ba

细菌性阴道炎(BV)——综合症表现为阴道分泌物,气味,discomfort-affects全球30%的女性gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。它与高多样性的存在,gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba缺乏厌氧阴道微生物群,风险增加的不利性和生殖的结果,如早产,流产,子宫发育不良,性传播感染,包括艾滋病毒gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。抗生素治疗,最常见的是灭滴灵,减少BV-associated微生物的绝对数量,暂时改善症状,但BV复发高达30 - 60%一个月后完成治疗gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

两种最普遍和丰富的阴道gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba物种gydF4y2Ba乳酸菌crispatusgydF4y2Ba,这通常与有益的健康结果相关,和gydF4y2Ba乳酸菌内心gydF4y2Ba与微生物群落不稳定,不良的结果,和过渡到多元化,BV-like社区gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。交付的外生gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba阴道作为生活biotherapeutic研究对于预防复发BV,但多个研究显示适度的好处gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}。在试验的2 b阶段益生菌组成的单一的一种gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba(LACTIN-V), 5每日和每周给药剂量11周后,30%的女性在治疗手臂BV复发后立即停止治疗,增加39%额外的12周后没有治疗gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。一株益生菌可能只展示部分功效因为各种各样的原因:一个假设是,多样的细菌,噬菌体,以及小分子组成的整体健康阴道的生态系统,以及它们之间的交互,可能需要支持乳酸杆菌和可持续社区转变。提出了类似的假设来解释粪便微生物群的成功移植(FMT)治疗复发性gydF4y2Ba艰难梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba结肠炎在肠道gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

阴道微生物群移植(车辆行驶里程),整个阴道分泌物的转移从一个健康的人高gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba丰度,提出了一个解决方案建立一个健康的抗生素治疗后阴道微生物BV。人类2019年,车辆行驶里程的第一份报告证明缓解4 BV的5名妇女多次治疗2年以上用抗生素之后,少量的新鲜的阴道分泌物gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba。作者报道,没有明显的副作用,没有严重的不良事件。而缺乏不良结果报道在这项研究是可靠的,研究尺寸小和缺乏安慰剂手臂很难解释车辆行驶里程是否提供了一个额外的好处在抗生素。另一组发表更广泛的提议描述描述的捐助者,确保安全的车辆行驶里程和采集阴道分泌物的性质gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。然而,对于车辆行驶里程是一个可行的治疗BV,策略有效识别合适的捐助者,以及优化方法收集、筛选和存储捐赠的材料是必要的。gydF4y2Ba

这里我们描述三个阴道分泌物捐助者的招聘和招生第一食品和药物管理局(FDA)批准的临床试验新药为车辆行驶里程(印第安纳州)协议。除了一般捐赠者的健康筛查和捐赠者没有传染病,我们概述额外的安全检查措施的捐赠者和捐赠的材料。此外,我们展示的可比性捐款和整除留给分析和显示稳定可行gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba随着时间的推移在捐款。这个协议,描述了捐赠会议所有质量量度,将用于促进车辆行驶里程的随机试验计划gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba占主导地位的阴道微生物群落的病人被诊断为复发性BV。gydF4y2Ba

捐款收集优化gydF4y2Ba

我们招收飞行员捐赠(供体0)最初优化样本收集和处理程序,并确认协议的可行性。阴道分泌物收集使用一次性捐赠月经杯和材料用无菌盐水从捐赠者0是均质(见方法)。捐赠的材料被分成几个“分析整除,”被储存在−测试80°CgydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba生存能力随着时间的推移,剩下的“捐赠整除”用于最终的移植。捐赠者提供5 0捐款超过9天,中位数为400μL阴道分泌物的捐赠(范围100 - 1000 <μL)。13个月后储存在−80°C,gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba集落形成单位(CFU)数量相似的整除的两种类型:中位数3.7×10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU /毫升的捐赠比5.3×10整除gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU /毫升分析整除(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

微生物群落组成的捐赠和分析整除细菌16 s rRNA扩增子测序显示两整除的细菌社区档案类型几乎相同在每个计算(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)的相对丰度gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba和gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba变化随着时间的推移,整个五捐款,但是gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba一直在更高的相对丰度(66.9 - -96.0%)比gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba(0.35 - -24.9%)。非gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba类群代表<总额的0.8%为每个样本相对丰富。基于降低CFU计数在单个捐款最低的体积,我们设置一个保守的最低门槛700μL捐款是可以接受使用。然而,降低CFU计数对于此示例可能部分由于更高的相对丰度gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba夫人,这通常不长(deMan Rogosa,夏普)琼脂用于gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba培养。gydF4y2Ba

捐献者登记gydF4y2Ba

展示捐款收集的可行性之后,我们为试验性新药获得FDA批准协议(# 018173)。2019年3月至2020年11月,我们筛选49额外的女人通过电话和8面对面进行筛选访问登记三个捐助者捐助者(1 - 3)(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba研究)。女性被认为如果他们绝经前,Nugent 0 - 3分,同意放弃性行为在整个捐款,并否认有任何BV的历史。一组广泛的包含和排除标准被用于最后的筛选(见方法)。四个潜在的捐赠者筛选失败由于纽金特得分> 3,和一个人不可能筛查实验室最近由于献血和没有回复接受随访完成筛选。gydF4y2Ba

捐赠者筛选gydF4y2Ba

所有三个捐助者确认为白色,cis-gender妇女和报道偏爱男性的性伴侣。捐助者1和3是使用口服避孕药和捐助2使用宫内节育器曼月乐IUD避孕。筛查的完整列表中列出的表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,其中包括测试屏幕基础医学并存病(可接受的范围在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。捐赠的人口统计变量包括年龄、种族和BMI是包括在表中gydF4y2BaS2gydF4y2Ba。注册捐助者通过了全面测试潜在的传染性感染在招生,最后捐赠访问,最后捐赠后30 - 45天(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。这保证事件的识别感染整个捐款期间。参与者同意捐赠期间保持禁欲方面。每个人捐赠是检测前列腺特异性抗原(PSA)处理确认的时候没有精子的情况下,为每个捐赠进行了测试和分析整除HPV和再次使用Y-chromosome-specific PCR测定精子。2020年6月开始,所有捐助者接受鼻拭子PCR检测SARS-CoV-2入学之前,每个捐赠前症状筛查,每个捐赠被rt - PCR检测SARS-CoV-2。gydF4y2Ba

捐款收集潜在的车辆行驶里程gydF4y2Ba

捐赠1提供八个捐款超过12天,平均体积为0.4毫升(范围0.1 - -0.8毫升)和平均体重1.42克(范围1.0 - -1.8 g)(图gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。捐助2提供20捐款超过37天,平均体积为0.75毫升(范围0.3 - -1.1毫升)和平均体重1.3克(范围1.1 - -2.0 g)。供体3提供14捐款超过40天,平均体积为0.55毫升(范围0.4 - -0.9毫升)和平均体重1.1克(范围0.5 - -1.5 g)。所有捐赠了pH值< 4.8和所有捐助者Nugent < 4分的捐赠。gydF4y2Ba

捐赠的特点为潜在的车辆行驶里程gydF4y2Ba

所有捐款捐赠1,纽金特分数范围从0 - 1(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Baa)。对大多数革兰氏染色剂幻灯片,没有白血细胞(白细胞)现在或< 1的白细胞、上皮细胞,但> 1 WBC /上皮细胞被认为在2捐赠样品(1 - 6)(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。高白细胞的数量通常表明阴道感染,但是这种捐赠了负测试已知的感染。对于捐赠者2,纽金特的分值范围从0到3。类似于捐赠1,没有白细胞或< 1的白细胞/上皮细胞除了1天(样品20)。供体3 Nugent 0 - 1的分数,没有样本> 1 WBC /上皮细胞。gydF4y2Ba

确定细菌群落组成的车辆行驶里程捐赠者,我们使用16 s rRNA扩增子测序以及特有的qPCR化验gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba和gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba。我们发现供者捐献1和3gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba主导整个捐款段(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。捐赠者2,然而,不同级别的gydF4y2Bal . jenseniigydF4y2Ba和gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba,几乎占据整个社区捐赠样本。gydF4y2Ba

使用特有的qPCR化验,gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba和/或gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba被发现在这些捐助者几乎相互排斥。在捐助2中,qPCR结果显示高数量的gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba没有检测到gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba表明,尽管正常Nugent分数,主gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba物种是不gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba,而是gydF4y2Bal . jenseniigydF4y2Ba。此外,尽管gydF4y2Bal . jenseniigydF4y2Ba有较高的相对丰度16 s rRNA测序,绝对的数量gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba捐赠的捐赠者2高(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

乳酸菌gydF4y2Ba可行性未经处理的存储后−80°CgydF4y2Ba

虽然以前的研究新的捐赠用于车辆行驶里程,对于长期使用和可伸缩性的捐赠的材料,最优存储协议是必要的。我们旨在最大化生存的细菌在样本时间和最小化任何修改材料。我们因此冻结分析整除的捐款没有添加甘油或其他冷冻保护剂−80°C和用整除量化的稳定性gydF4y2BaLactobacillugydF4y2Ba年代,措施可行gydF4y2BaLactobacillugydF4y2Ba年代cfu存储后−80°C,从每个捐赠整除连续稀释和镀gydF4y2Ba乳酸菌,gydF4y2Ba选择性琼脂板(图太太。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba为捐赠1 c)。gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba可行性(CFU /毫升的样品)稳定在30天(平均2.8×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba范围4.5×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-1.0×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba),3个月(平均5.2×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba范围5.3×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba9×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba),6个月(平均3.7×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba范围1.2×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba-1.5×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba),11个月(平均1.7×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba范围5.5×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-1.1×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba)收集后。对于捐赠者2,gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba可行性(CFU /毫升)最初30天(平均2.0×10之间的稳定gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba范围4.7×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-5.6×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba)和3个月(平均1.1×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba范围1.9×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-2.9×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba)但拒绝在9个月(平均5.2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba、范围8×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba-1.1×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba)。这种下降可能是由于不同社区的构成和相关的差异gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba的混合物gydF4y2Bal . jenseniigydF4y2Ba和gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba,后者通常并不生长在太太供体3类似于捐赠1,稳定CFU计数当比较数据收集(中位数1.8×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba1.5×10 CFU / mL,范围gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-5.8×10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU /毫升),3个月(平均1.6×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba3.6×10 CFU / mL,范围gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-2.8×10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU /毫升)和6个月(平均1.2×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba3.4×10 CFU / mL,范围gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba3.8×10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU /毫升)。这表明,捐款gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba占主导地位的社区可以存储不需要冷冻保护剂。gydF4y2Ba

当车辆行驶里程已被建议作为一个潜在的策略来预防复发BV,详细的安全性、可行性和有效性测试需要在此之前可以考虑作为临床护理的一个选项。在这里,我们描述一个广泛的安全协议为车辆行驶里程阴道分泌物的筛选和收集捐款。在我们的筛选策略,我们测试参与者之前,期间和之后的捐赠,以确保他们没有或没有最近感染常见性传播病原体。我们也确认没有精子或精子捐赠的材料。我们表明,该集合协议是可行的,与我们的招生3捐助者,谁在一起提供了一个共有42剂量的至少700μL每个。此外,我们处理协议导致捐赠整除与可行的乳酸杆菌在几个月的存储在- 80°C,和我们的分析能整除反映捐赠整除的特点,将重要的描述成功的捐款。gydF4y2Ba

在所有三个捐助者显示稳定gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba可行性−80°C存储3个月,有1 - 2个数量级的生存能力下降捐赠样本2在9个月。对于这个捐赠,6个月时间点不是由于COVID-19大流行。分子分析表明,这个捐赠的多数gydF4y2Bal . jenseniigydF4y2Ba和高的绝对数量gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba相比,其他两个相对和绝对丰度高的捐助者gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba。有可能是不同的gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba物种生存不同的冻结,或另一个属性的阴道分泌物捐助者之间的不同(例如,糖原内容)导致了这种差异在长期生存能力。我们第一次随机试验的阴道分泌物移植,我们的目标是1)优先考虑接受者的安全,和2)来限制我们的操纵的阴道分泌物,所以我们最好能够识别功能与效益(或缺乏)。出于这个原因,我们不包括防冷冻的解决方案在处理donations-we担心这些可能增加的风险在接受者酵母菌病,他们可能会模糊我们描述捐款的能力特征。根据我们的研究结果,我们认为,使用冷冻保护剂是不必要的,如果1×10的最低浓度gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU /毫升gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba是礼物。此外,由于生存能力的差异我们决定仅包括捐款gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba占主导地位。gydF4y2Ba

我们最初的目的是要做尽可能少的微生物群的特征选择捐赠的材料之前,保持不可知论者,可能是有益的组件或最优的阴道分泌物的成分。然而,捐赠的可行性材料突出的差异在屏幕使用纽金特得分捐助者的挑战。尽管纽金特方法是高效、快速,它导致了招生的捐赠者gydF4y2Bal . jenseniigydF4y2Ba占主导地位的社区具有高的绝对数量gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba。这种捐款材料不稳定时,储存在−80°CgydF4y2Bal . crispatus -gydF4y2Ba主要来自两个其他捐助者的捐款。使用特有的qPCR化验gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba和gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba测试捐赠物质明确区分这两个最优捐赠者的捐赠比例和数量的gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba。基于这些结果,我们建议筛选未来qPCR和排除的捐款或捐赠的绝对丰度竞争gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba相比gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba。我们选择了把重点放在这两个物种是最常见的确定主要在阴道乳酸杆菌,因为水平时的生存能力的差异gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba高,gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba不在。我们建议的浓度gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba至少三个数量级高于gydF4y2Bal .内心。gydF4y2Ba拟议中的qPCR策略是更快、更便宜比完成16 s rRNA扩增子测序为每个捐赠和将允许快速评估的适用性捐款而等待的微生物群的更全面的描述发生在研究分析阶段。gydF4y2Ba

我们的捐助者和捐款被广泛的安全检查。值得注意的是,任何个人捐赠HPV阳性,表明没有间歇流人乳头状瘤病毒的捐助者,他们有一个消极的HPV筛查子宫颈抹片检查测试。此外,没有个人捐款PSA或染色体阳性,表明捐赠者捐赠期间这也投了弃权票性交。分析可以检测精液1:512稀释和已被证明检测精液性接触后5天gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。这广泛的测试/精液精子诱导妊娠的风险最小化在接受者和最小化收购性传播感染的可能性。此外,可行的精子是不可能生存冻结/解冻过程中,添加一个额外的安全水平。gydF4y2Ba

车辆行驶里程是一种很有前途的战略推广gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba主要在复发性BV患者阴道微生物群。车辆行驶里程的研究还将提供一个新颖的机会识别宿主和微生物的决定因素gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba殖民和毅力。这份报告描述了一个可行的、可再生的协议收集捐赠的阴道分泌物与保障措施,以确保接收方的安全gydF4y2Ba。gydF4y2Ba我们的协议不同于发表报告的车辆行驶里程的方法收集、储存的冷冻捐款到多个安全测试已经完成,直接从捐赠的材料和创建分析整除(而不是拭子同时收集)。最小的处理在我们的协议维护乳酸杆菌的生存能力和将使我们能够评估整个阴道分泌物对接受者的影响微生物群和粘膜免疫,而不被蒙羞的冷冻保护剂或稳定的化合物。拟议中的最小处理捐赠的材料,我们持续数10之间gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba和10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba700 CFU /毫升,这意味着一个剂量的μL将10之间gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba和10gydF4y2Ba^9gydF4y2BaCFU。这个浓度与剂量Lactin-V,gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba活2019年biotherapeutic Phase2b临床试验中使用gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。最后,分析整除有助于识别特征的保留与成功的结果(例如,特定的菌株与成功)。gydF4y2Ba

尽管BV的高患病率,缺乏持久的治疗反应与目前的治疗方法,没有一个全新治疗几十年来BV。车辆行驶里程是阴道的策略来获得洞察决定因素与有益的乳酸杆菌和殖民的发展贡献BV治疗和预防的新策略。成功的收集、测试和储存捐赠的阴道分泌物是这一目标的第一步。gydF4y2Ba

捐赠者招聘gydF4y2Ba

潜在的捐赠者是被网站的帖子,传单,招聘从先前的研究,和广告。海报被安置在性健康和妇科诊所以及当地大学的校园。gydF4y2Ba

我们合格的捐献者定义为健康,绝经前(年龄18-40),没有怀孕的人从未有过BV的诊断,是性经验(因此有机会获得BV),并且愿意放弃任何性活动的持续时间筛选和捐赠。在最初的筛选,捐赠者需要阴道液pH值< 4.8,纽金特得分介于0和3。潜在的捐赠者进行筛选基于美国血库协会(AABB)捐赠接触传染性病原体的问卷。作为问卷艺术展的一部分,潜在的捐赠者也被问及他们的药物和排除如果服药不认为安全的献血者。2020年6月后,协议被修改排除参与者宣布拥有COVID-19症状在手机屏幕上。排除标准包括:历史non-BV cervicovaginal感染在过去的一年;子宫颈抹片检查异常或积极测试高危人乳头状瘤病毒在过去的一年;使用益生菌之前30天内;口腔或阴道内抗生素之前3个月;生殖器疱疹的历史; abnormal findings on physical exam; personal travel in prior 6 months to a country or territory with active Zika outbreak (based on CDC guidelines) or unprotected sex in the preceding month with a partner who traveled to an area with active Zika in the prior 6 months.

捐赠者筛选gydF4y2Ba

捐赠者是检测病毒、细菌和真菌感染(艾滋病毒、肝炎A, B, C,单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、梅毒、人类T-lymphotrophic病毒(HTLV 1和2),eb病毒(EBV)、淋病、衣原体、滴虫、念珠菌,和gydF4y2Ba尿道支原体)gydF4y2Ba之前,结束时,捐赠后30天期(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)。此外,在招生,捐赠者有一个完整的血细胞计数,基本代谢面板、糖化血红蛋白、肝功能测试检查屏幕基础医学并存病。2020年6月后,所有捐助者也接受鼻拭子PCR检测SARS CoV-2前登记预约。尿液非法药物毒理学的屏幕,怀孕测试,子宫颈抹片检查HPV检测也表现在入学的时候。CLIA-certified医院执行所有的测试实验室,根据常规临床测试程序。任何积极的测试(除了HSV1免疫球蛋白或巨细胞病毒免疫球蛋白)导致排斥。捐赠1阳性了HSV1免疫球蛋白和巨细胞病毒免疫球蛋白。我们的协议规定,在这种情况下每个捐赠将与PCR检测HSV或巨细胞病毒,如果积极排除在外。然而,由于COVID-19流行这些捐款过期之前确认测试执行。捐赠人同意放弃性接触(包括口腔、阴道、肛门给予或接收)期间的捐赠。gydF4y2Ba

捐款收集和测试gydF4y2Ba

捐赠时间开始后3 - 10天参与者月经期的最后一天。每个协议,捐助者可以提供20捐款在45天的窗口。捐赠阴道分泌物,参与者插入一次性月经杯(Softdisc) 6 - 12小时到达临床网站之前,现场,把杯,研究人员立即处理捐赠。gydF4y2Ba

阴道分泌物收集从Softdisc离心在无菌50毫升锥形管810×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 10分钟,稀释500μL无菌生理盐水和剪切冲16-gauge针钉连接解决方案。材料留在Softdisc的拭子是用来制作一个幻灯片Nugent得分和测试使用前列腺特异性抗原(PSA)卡精液gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。每个捐赠被整除为治疗剂量(至少700μL),和几个50μL aliquots进行纵向分析gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba可行性测试和描述的组件成功移植的剂量。gydF4y2Ba

分析整除被用来测试使用一个染色体PCR对精液的存在gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba,对于高危人乳头状瘤病毒利用BD Oncoclarity测试在医院临床实验室gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2BaCFU计数被解冻一个单独的量化分析整除,执行串行稀释,和电镀10µl(1:10稀释样品gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba1:10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba哈迪夫人平皿上)一式三份(诊断)在厌氧条件下(5% H2/5%CO2/90%N2厌氧混合气体)。盘子在37°C孵化Bactron厌氧室前两天计数。殖民地的数量计算手动为每个稀释少于每10 100殖民地µl复制。gydF4y2Ba

DNA提取额外分析整除使用手动酚氯仿抽提和用于测序的V4地区16 s rRNA基因如前所述gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。单头测序进行一个Illumina公司MiSeq使用v2 300 -循环设备。数据去复用使用自定义python脚本并使用DADA2去噪gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。使用RDP分类法的扩增子序列变异被分配gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba除了手动策划作业。最后,使用phyloseq R中的数据进行了分析gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

量化的gydF4y2Bal . crispatusgydF4y2Ba和gydF4y2Bal .内心的gydF4y2Ba进行了使用TaqMan qPCR化验如前所述gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。短暂5 ul的DNA用于总共20 ul在45种特异的引物和探针扩增反应周期。质粒标准曲线是用来计算数量的16 s rRNA基因拷贝/反应和数据标准化捐赠样本的体积。具体的表提供了条件gydF4y2BaS3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理参数gydF4y2Ba

所有参与者签署知情同意,所有程序都执行每个人体批准协议(合作伙伴人体试验委员会2018 p000057)。gydF4y2Ba