简介

通过消毒或灭菌消除医疗设备上潜在的致病微生物是制造商必须满足的一项关键要求，以确保患者安全和符合卫生当局的标准。根据美国疾病控制和预防中心(CDC)的定义，灭菌是“在医疗机构中通过物理或化学手段完全消除或破坏所有形式的微生物生命”。因此，灭菌不应与消毒混淆，后者的定义是“除细菌孢子外，消除许多或所有微生物的过程”。1，2．

有多种消毒或灭菌方法，在日常实践中，根据消除微生物污染物的必要性和需要去污的设备的特性而应用2，3.．臭氧气体目前被用作传统消毒剂的可行替代品，在使用液体消毒剂可能被证明与某些生物材料不兼容的情况下特别有效4．其他常见的消毒方法依赖于使用其他氧化剂，如次氯酸钠、聚维酮碘、过氧化氢或过氧乙酸5．替代方案依赖于使用酒精、氯己定、季铵化合物或戊二醛5．为了达到完全消除孢子，高压灭菌，环氧乙烷，过氧化氢蒸汽，或等离子体是首选5，6．特别是，汽化过氧化氢广泛用于医疗设备的灭菌，是非热气体灭菌方法的重要支柱7．

“斯波尔丁分类”有助于选择适当的微生物去污水平，这对可重复使用的医疗设备特别有帮助8．使用医疗设备的患者的感染风险决定了适当的去污程序的选择。具体来说，spulding对医疗器械定义了三种不同的分类，即危急、半危急和非危急。关键医疗设备包括进入或接触无菌组织的设备实体，半关键设备包括接触皮肤或膜而不穿透它们的设备，最后非关键设备包括只接触完整皮肤而不接触粘膜的设备8．这三类是根据感染风险的严重程度划分的8，9．

囊性纤维化(CF)是一种使患者特别容易受到微生物定植和机会性感染的临床疾病，这是一种遗传性疾病，由于CF跨膜导电调节蛋白的突变，导致肺部粘液异常积聚10，11．因此，CF患者更易受到机会性细菌病原体的气道定植和感染。一个例子的病原体，利用黏液积累在呼吸道的CF患者是铜绿假单胞菌12．这种细菌是一种具有特殊临床意义的非孢子性需氧病原体，可引起一系列呼吸道、尿道和手术部位感染以及菌血症13．对CF患者的治疗铜绿假单胞菌依赖于吸入抗生素，如粘菌素、妥布霉素、氨曲南或左氧氟沙星14．由于长期服用抗生素可能会引起细菌耐药性，因此尽量减少患者的抗生素暴露是很重要的铜绿假单胞菌．因此，需要简单的程序从CF患者日常使用的吸入设备中去除这种病原体。此外，雾化器等设备通常在家中使用，这需要用户友好的去污协议，不涉及有毒试剂或复杂的设备。先前的研究表明，臭氧处理仅5分钟就可以实现这一目标15．

一种潜在的有吸引力的家用消毒程序可能是基于细菌暴露于活性氧(ROS)。这些活性氧包括高活性自由基、过氧化物和来源于分子氧(O2)，对细菌细胞造成致命伤害16，17．然而，活性氧的杀菌作用只有在氧气/活性氧暴露与细菌抗氧化防御之间不平衡时才会显现出来18，19．例如，许多细菌能够通过部署特定的酶来减轻氧和ROS的破坏性影响，如过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶17．氧气和活性氧对细菌的危害程度通常取决于其生态位中的氧气水平。因此，在需氧菌和厌氧菌之间可以做出广泛的区分，前者能够释放抗氧化酶，而后者缺乏这种能力。氧通常对厌氧菌是有毒的，例如严格的厌氧菌可以耐受最多0.5%的氧，而中度专性厌氧菌可以耐受2-8%的氧20.．另一方面，抗氧化剂和活性氧清除酶的存在使需氧菌对大气(21%)氧气具有耐受性。重要的是，氧化剂/抗氧化平衡可以通过过度暴露于氧气和ROS来打破细菌的防御机制并导致细菌死亡21．

本研究的范围是调查以氧为基础的治疗是否能有效地清除CF患者在家使用的医疗设备上的细菌，并将其与常用消毒剂(如乙醇和过氧化氢)的效果进行比较。为此，研究人员检测了含氧量高于21%的气体混合物，以检测用于治疗CF患者的雾化器的潜在净化作用。

材料与方法

细菌和生长条件

对于目前的原理验证研究，我们应用了特征良好且易于获得的细菌类型菌株，以促进实验室间的比较。具体地说，在整个实验中使用了以下菌株:大肠杆菌写明ATCC 25922,金黄色葡萄球菌hg - 001,粪肠球菌写明ATCC 29212,粪肠球菌写明ATCC 51299,肺炎克雷伯菌ATCC 11228和铜绿假单胞菌写明ATCC 27853。每个菌株在20%甘油中保存，-80°C冷冻。从冷冻储藏开始，每个菌株被镀在血琼脂(BA)板上，在37°C下生长一夜。第2天，选择5-6个菌落接种20ml溶菌发生液(LB;Oxoid)。用100 ml玻璃瓶在37℃、250 rpm震动下培养细菌4小时。适当稀释得到最终的起始接种物，测量光密度为600 nm (OD)600)为0.05。值得注意的是，我们用了OD600在整个本研究中，细菌细胞密度的测量标准，而不是替代的麦克法兰标准22，23．

细菌氧敏感性试验

不同的细菌按上述方法培养。1 ×磷酸盐缓冲盐水(PBS)培养悬浮液，对应于2-4 × 106以菌落形成单位(CFU)/mL为起始接种量。使用24孔板，由20 μ L接种物组成的3个副本分布在各个孔的底部。然后将平板在层流气流(LAF)柜中打开盖子风干1.5小时。干燥后，将平板转移到定制的气体培养箱(图2)。1)．将培养箱盖关闭，随后用所选的氧气混合物在0.8 kPa的压力下冲洗5分钟。随后，停止气体流动，并关闭培养箱的进出口。分别在室温(RT)下处理1、5、10或30分钟。处理结束后，打开培养箱，24孔板在RT下孵育20小时。然后每个孔用600µL的PBS 1x冲洗，收集细菌。最后，通过连续稀释、镀BA和菌落计数来定量剩余的活菌，从而计算出各自的CFU/mL。

图1
图1

气体培养室的实验设置。由(1)，气瓶连接压力阀(2)．塑胶管(3.)将压力阀连接到培养箱入口(4)．在培养箱上，也有一个压力阀(5)．在孵化器内(6)实验琼脂板(7)或放置24孔微量滴定板(图中未示)。一旦培养箱用盖子密封，并用适当的气体混合物冲洗，气体就可以通过一个出口(8)位于进气道的极对面。最后，可调节管连接到可关闭的出口(9)．

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气体培养箱和氧气混合物

气体培养箱如图所示。1由格罗宁根大学医学中心(UMCG;“研究Instrumenten-makerij”)。孵化器设计为矩形形状，尺寸为300毫米× 140毫米，高度为40毫米。每个培养箱都设计有一个入口和一个出口，以允许气体流动，以及一个安全压力阀。培养箱由两个独立的部分组成，腔室和盖。这些房间通过位于每个房间一侧的四个金属夹子用盖子密封。本实验选择的氧浓度分别为:42%、53%、63%和87%，氧仅与氮补充。此外，对照实验是在常规空气中进行的，下文中称为21%的氧气。

喷雾器

Ventobra喷雾器24由PARI Pharma商业化，威斯特法伦A.G公司供应，被选为实验性氧介导消毒过程的代表性医疗设备。根据斯波尔丁标准，该设备是“半临界”的。Ventobra系统最近被欧洲药品管理局批准用于CF患者(EMA/169,512/2015 Page 3/3)。在我们的研究中，特别注意了公差®Ventobra喷雾器的手持设备，用作不同消毒方案的目标。

喷雾器的微生物污染和净化

如图所示，tolerance o手机被拆解为三个不同的部分，即塑料膜(MB)、口片(MP)和金属片(MT)。2．选择用于污染实验的细菌为铜绿假单胞菌ATCC 27,853，按上述方式生长。通过用2-4 × 10的细菌悬浮液接触~ 10 s，故意污染了三个分离的设备部件的表面6CFU/mL PBS (OD6000.05)。三个被污染的设备部件然后在LAF柜中风干，随后放置在气体培养箱中，用测试的最高氧浓度(87% O)的连续通量进行处理2，作用30分钟(0.8 kPa)。处理后，采用两种方法来评估设备部件表面的细菌数量。“冲压”方法需要将每个喷雾器部件接触到BA板上。相比之下，“擦洗”方法需要用无菌棉签从设备部件表面收集细菌，然后在BA板上划线。然后将BA板在37°C下孵育过夜，并在第二天检查细菌生长情况。

图2
图2

容忍喷雾器的听筒。图像的上半部分显示了完全组装的手机，而图像的下半部分显示了其拆卸后的三个主要部件，即话筒(MP)，膜(MB)和金属部分(MT)。

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为了控制，冲压和擦洗方法分别应用于两种不同的方法。首先，通过70%乙醇或30%双氧水浸泡10分钟消毒三个故意污染的设备部件，在LAF柜中风干10分钟，并测试细菌污染。这使我们能够在重复使用之前验证设备部件没有细菌。其次，为了确保在细菌(再次)污染之前，设备表面没有消毒剂的痕迹，这可能会混淆我们的实验结果，用70%乙醇或30%双氧水消毒的部件浸泡在无菌MilliQ水中10秒。

统计分析

结果以平均+ /−标准偏差表示。使用GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, USA)对数据进行统计分析p-value < 0.05被认为是显著的。检验采用双因素方差分析。

结果

细菌对氧混合物的易感性

通过将不同特征良好的细菌类型菌株暴露在气体培养箱中21%(即普通空气)、43%或53%的氧气中，研究了它们的耐氧性。如图所示。3.，4而且5观察不同的氧敏感性取决于所测试的菌株。特别是在孵育30 min时，CFU计数表明金黄色葡萄球菌hg - 001,粪大肠写明ATCC 29212,粪大肠ATCC 51,299和大肠杆菌ATCC 25、922对氧的敏感性一般低于铜绿假单胞菌ATCC 27,853;3.)．而可行的数量金黄色葡萄球菌hg - 001和大肠杆菌在53%的氧气浓度下，ATCC 25,922细菌减少了约10倍，在这个氧气浓度下，两种细菌的活菌数量没有或最多减少10倍粪大肠菌株分别为ATCC 29,212和ATCC 51,299。相比之下，的可行计数铜绿假单胞菌当氧气浓度高于21%时，ATCC 27,853降低了500- 100倍(图2)。3.)，表明这种细菌最容易受到分子氧的影响。

图3
图3

细菌对氧气的敏感性。细菌对氧的敏感性以CFU/mL表示。在21%、42%、53%三种不同氧浓度下孵育时间为30 min。双向方差分析显示，在增加氧气浓度时，细菌菌株的生存能力有统计学上的显著差异(p-value < 0.0001)。值得注意的是，我们认为氧敏感性明显略高铜绿假单胞菌42% O2比53%的O2尽管CFU/mL计数的差异显示出统计学意义，但这一特定系列实验的设置存在差异。

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图4
图4

氧介导的时间依赖性杀伤(一个）金黄色葡萄球菌HG-001及(B）铜绿假单胞菌写明ATCC 27853。金黄色葡萄球菌hg - 001和铜绿假单胞菌ATCC 27,853例，63% O21、5、10或30分钟，并镀在BA琼脂上。

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图5
图5

的生存铜绿假单胞菌ATCC 27,853和金黄色葡萄球菌HG-001暴露于63%的分子氧中，对照组在21%的氧气中孵育。细菌对氧的敏感性以CFU/mL表示。孵育时间分别为1、5、10、30 min。通过双因素方差分析，不同时间点菌株活力差异有统计学意义(p -value < 0.0001)。

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以确定三倍的大气氧气条件是否能更有效地消除金黄色葡萄球菌hg - 001和铜绿假单胞菌ATCC 27,853，为了接近最佳孵育时间，进行了接下来的一系列实验。如图所示。4而且5，含氧量为63%，可存活数为铜绿假单胞菌ATCC 27,853随着时间的推移迅速下降，在培养10分钟后基本上所有细菌都被消灭。相比之下,金黄色葡萄球菌HG-001对63%的氧气暴露表现出更高的耐受性，在孵育30分钟后，活菌数减少了约10倍。

喷雾器手机消毒

为了评估氧气消毒喷雾器手持设备的可能性，将Ventobra喷雾器的Tolero手持设备拆分成三个主要部分:膜(MB)、金属部分(MT)和吹口(MP)。这三个部分分别被污染了铜绿假单胞菌写明ATCC 27853。为了研究可能的氧介导消毒，将三个被污染的部分暴露在87%的氧气中30分钟。选择这种条件是为了确保最大限度的氧气暴露。作为对照，污染部位分别用70%乙醇或30%双氧水消毒。在氧气暴露或用乙醇或过氧化氢消毒后，不同的部分被“印”在BA板上，随后在37°C下孵育一夜。数字6说明用乙醇或双氧水消毒可使细菌完全消灭。

图6
图6

乙醇或过氧化氢介导的消毒雾化器部件污染铜绿假单胞菌写明ATCC 27853。用70%乙醇或30%双氧水(H2O2)．随后在37°C下孵育过夜。黄色箭头标记双氧水产生的泡沫点。MB,膜;MT，金属零件;MP,喉舌。

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数字7显示了87%氧介导消毒的效果铜绿假单胞菌,被污染的喷雾器部件。在氧气暴露30分钟后，三个部位的细菌负荷都明显减少，但受污染的口腔部分的细菌负荷尤其明显。这是通过冲压和擦洗方法可视化。

图7
图7

氧介导消毒雾化器被污染部位铜绿假单胞菌写明ATCC 27853。在87%氧气处理30分钟之前或之后，将被细菌污染的喷雾器部件压在BA板上。另外，在用87%的氧气处理30分钟之前或之后，用棉签棒擦拭有意被细菌污染的雾化器部分，随后从棉签棒上重新悬浮细菌。所有培养皿在37°C下孵育过夜。MB,膜;MT，金属零件;MP,喉舌。

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讨论

在本研究中，我们测试了基于氧的消毒方法对一组机会致病菌的有效性，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌物种。这些细菌暴露在不同浓度的氧气中，远远高于21%的大气浓度。我们的研究结果表明，对氧气的敏感性取决于不同的因素，如细菌种类、治疗时间和氧气含量。有趣的是，在测试的细菌中，铜绿假单胞菌表现出最高的氧敏感性。此外，我们表明，可以利用氧敏感性的优势铜绿假单胞菌以减少其在医疗设备上的负荷，例如tolerance o手机喷雾器。这款手机是由肺部疾病如CF患者使用的，因此，它经常被污染铜绿假单胞菌。而我们目前的研究表明，传统的消毒剂，如乙醇或过氧化氢，在消除高负荷污染方面更有效铜绿假单胞菌，我们必须认识到，本研究中应用于设备部件的高细菌负荷不太可能通过日常使用达到。重要的是，我们的观察表明，氧气介导的去污效果最有效的是在使用过程中，口腔内的微生物接触最多的部分是口腔罩。

虽然氧是一种有效的电子受体，为生命的三个王国中的许多生物的新陈代谢提供燃料，但它也是一种有效的有毒物质。我们星球的大气含氧量高达21%，好氧微生物和包括人类在内的高等生物都已经学会了应对这种潜在的危险环境条件。一般来说，原核生物比真核生物更能抵抗40%以上的氧气浓度25，26．因此，提高氧气水平实际上可以用于促进生物反应器中的微生物生长，尽管长时间暴露可能导致生产微生物及其产物的氧化损伤27，28．然而，令人吃惊的是，人们对不同种类细菌耐氧的绝对极限知之甚少。特别是，对厌氧菌的耐氧性进行了非常详细的研究，直到大气中氧气浓度为21%的限制，因为更高的氧气浓度被认为是不生理的29，30.．出于同样的原因，很少有人关注好氧细菌的耐氧极限，即使是那些喜欢氧张力波动的小生境，如人类呼吸道。这就提出了一个问题，这些好氧细菌，包括机会性病原体，在多大程度上铜绿假单胞菌可以处理高于21%的氧气浓度。因此，本研究旨在探索含氧量高于大气21%的混合气体的潜在杀菌效果，并评估这种高浓度的氧气是否可以应用于消毒医疗设备。我们的结果表明铜绿假单胞菌特别容易受到高氧含量的影响。我们认为这个观察结果是相关的，因为铜绿假单胞菌是一种臭名昭著的肺功能受损患者(包括CF患者)的肺部定植者，这就需要尽量减少这些患者使用的医疗设备上的细菌负荷。

医疗器械的适当消毒和灭菌对于保护细菌定植和感染易感性增加的患者尤为重要。因此，医疗保健提供者和医疗设备开发商明确需要有效的协议，以消除或至少最大限度地减少虚弱患者接触潜在病原体的机会。此外，微生物污染会干扰医疗设备的功能。因此，细菌污染是一个经常危及设备安全的问题，特别是如果设备表面有相对较高的水活度，会促进微生物生长，并与患者直接接触31，32．与微生物净化相关的另一个重要考虑因素是昂贵设备的可重复使用性，否则这些设备在使用后将被丢弃。喷雾器属于这类昂贵的设备，具有很高的定植风险，需要有效的消毒程序，可以在家里使用。我们目前的研究结果表明，原则上，这可以通过将这些设备暴露在专用培养箱中的高氧浓度来实现。氧介导消毒的一个明显的附加价值是，与其他化学物质不同，分子氧不会影响雾化器和其他医疗设备的可重复使用性。

一种可能的附加价值来自于氧基治疗铜绿假单胞菌可能与这种细菌对CF患者肺部积聚的粘液的偏好有关。这种粘液中的氧气被耗尽，这将迫使细菌更多地依赖于无氧呼吸33．有趣的是，古普塔等人证明了这一点．，那铜绿假单胞菌在缺氧条件下，对抗生素的敏感性降低，特别是氨基糖苷类34．这一观察结果很重要，因为CF患者需要频繁服用抗生素，随着时间的推移，这些抗生素可能会因获得性细菌抗微生物药物耐药性而变得不那么有效。因此，用高氧浓度消毒雾化器可能有助于最大限度地减少CF患者对抗微生物药物的暴露铜绿假单胞菌．

总之，我们预计，分子氧的毒性作用可能成为对抗细菌病原体的强大盟友。氧气的优点是对人类使用是安全的，它是一种工具，可以抑制特定的机会性病原体的生长，这些病原体污染和定居在生物和非生物表面。因此，例如，它还可以应用于使用后的新生儿培养箱的消毒，因为这种培养箱是昂贵的设备，可能被对早产儿健康构成特别威胁的病原体污染32．这一原则甚至可以扩展到非医疗应用，包括食品工业，其中氧气水平升高与水分活度降低相结合可能有助于防止腐败。然而，氧气消毒方法的主要限制在于我们目前的研究中记录的微生物污染物的潜在不完全消除。确定氧气消毒效果的其他确定因素是污染细菌种类、氧气暴露时间和应用氧气浓度。因此，在找到针对这些潜在限制因素的适当解决方案之前，我们提倡将高氧与乙醇或过氧化氢等其他消毒剂结合使用。