宿主身份是南极干谷溪流中线虫和缓步动物肠道微生物群组装的主导因素

许多动物物种(如蚜虫、奶牛和人类)的肠道微生物群已被证明在宿主的生理机能中起着特定而重要的作用(如营养物质的消化，抵御病原体的保护)。¹．在这些动物中，由宿主物理、化学或行为特征产生的因素决定性地驱动肠道微生物群的组装和组成，这种生态进化模式被定义为系统共生²．然而，宿主与其微生物群的联系可能有很大差异。例如，某些动物(如蜻蜓和鳞翅目幼虫)的肠道微生物群。^3.，4是否更能反映宿主环境的微生物群落，人工去除这些微生物群落对宿主功能没有影响⁵．肠道微生物组组装的模式和驱动因素可能存在很大差异，即使在密切相关的宿主物种之间也是如此^5，6．例如，在蚁科的单一家族中，冠层蚂蚁(即Cephalotes)依靠肠道微生物群来循环氮并产生必需的氨基酸⁷，但地蚁(即Solenopsis而且大头蚁)没有任何肠道细菌⁶而是与冠层中没有的富含氮的植物联系在一起Cephalotes驻留⁸．这表明，一些动物的肠道微生物群可以仅依赖于环境因素，而不依赖于宿主身份和/或系统发育，而另一些动物可能受到两者的联合影响^9，10．

尽管我们对许多动物肠道微生物群的组装和功能有了更多的了解，但线虫和缓步动物物种的微生物群直到最近才开始研究。线虫是一种极其多样化的显微蛔虫门，估计物种丰富度在50万到1000万之间，尽管目前描述的物种不足3万¹¹．除了分类多样性外，线虫的生活策略(即r选择vs. k选择)和摄食习惯(例如，细菌食、杂食、植物寄生虫和捕食者)也有广泛的多样性。¹²．缓步动物是线虫最接近的门^13，14尽管有显著的解剖差异(例如，节段体和8条腿)，但它们的消化结构(即咽球和食管)、平均体型(< 1毫米)、基于蜕皮的生长、摄食习惯(例如，细菌动物、杂食动物和食肉动物)和行为(例如，觅食和使用无水生物)以及共享的摄食生态位具有显著的相似性¹⁵．

由于线虫在土壤分解和养分循环等过程中的重要性¹⁶以及在农业中通过植物和动物寄生¹⁷在美国，线虫肠道微生物群比缓步动物受到了更多的关注。利用DNA克隆文库进行的初步研究发现，几种食菌线虫的肠道微生物群落具有不同程度的微生物多样性(例如:，高Acrobelessp．比Prionchulussp和更高秀丽隐杆线虫比Acrobeloides马克西姆斯）^18，19．采用元条形码方法，对模型线虫的微生物群落进行了分析秀丽隐杆线虫(一种细菌类动物)最近被更详细地检查和描述^{20.，21，22，23，24}．现在已经很确定的是肠道微生物群秀丽隐杆线虫与自然栖息地底物(腐烂的水果)的微生物组不同²⁵．此外，秀丽隐杆线虫来自遥远地理位置的不同底物微生物群落具有惊人相似的肠道微生物群^20.，22．此外，肠道微生物组的比较秀丽隐杆线虫与它的姐妹物种相比，c . remanei，尽管它们的摄食习惯和环境生境相似，但它们的组成却存在差异^20.．

虽然肠道微生物群秀丽物种似乎是受宿主身份的驱使，暴露秀丽隐杆线虫不同的环境条件也会影响肠道微生物群的组成，但这一点还没有完全了解。例如，较高的环境温度可以导致富集Sphingobacterium在土壤基质内，但在土壤基质内消耗秀丽隐杆线虫肠道，而其他细菌类群(例如，农杆菌属)能以完全相反的方式回应吗²²展示了环境因素在形成线虫肠道微生物群组装中的复杂作用。虽然缓步动物微生物群的研究远远少于线虫，但它们似乎也具有宿主特异性，并且始终与周围环境截然不同^{26，27，28，29，30.}．然而，在不同的线虫门中观察到宿主身份的不同影响。比如，二者同时隐晦Litoditis海洋物种含有独特的微生物群³¹一项对33个海洋属的更广泛调查发现，寄主身份或摄食习惯并不重要，这表明它们的组合更加随机³²．不幸的是，线虫和缓步动物肠道微生物群落的特征只存在于少数物种中，这给我们在其余大多数微型无脊椎动物物种中驱动肠道群落组装的因素留下了巨大的空白，这些物种既具有系统发育多样性，又在生态系统中的功能角色差异很大。

为了开始更系统地评估驱动线虫和缓步动物微生物群组装的因素，我们使用麦克默多干谷作为一个简化的自然生态系统模型。麦克默多干谷是南极洲的一个无冰地区，其特点是无植被的砾石样土壤，强风，几乎没有降水。土壤内的温度可以下降到- 59°C³³这限制了一年中大部分时间的持续生物活动。然而，在南方夏季的8-12周内，温度足够温暖，足以融化邻近的冰川，产生液态水，从山坡流下，流入下面的盆地³⁴．Taylor Valley是本研究的地点，包含了许多季节性活跃的溪流，流入一系列永久被冰覆盖的湖泊(例如，Fryxell湖)(图。1a).在溪流中存在不同类型的形态可区分的蓝藻垫(例如，黑色和橙色)(图。1b, c)³⁵．每一种垫的特点是不同种类的光合作用蓝藻(黑色由念珠藻属橙色由振荡oriales设计)³⁵并支持一个独特而多样的微生物群落，在单一的溪流中彼此直接相邻³⁶．一般来说，黑色地垫建立在溪流边缘，橙色地垫建立在中心流。这两种垫子类型都为有限的、具有良好特征的微型无脊椎动物群落提供了栖息地，其中只有两种线虫(Plectus murrayi而且Eudorylaimus antarcticus strain(目前正在重新评估分类))，以及至少两种缓步动物(Acutuncus antarcticus strain而且MilnesiumSp .)和3-5种轮虫^37，38，39．由于其狭窄的漏斗状无武装气孔，p . murrayi被归类为细菌喂食者大肠antarcticus strain含有皮下针状的齿突，被归类为杂食动物⁴⁰．虽然大肠antarcticus strain被认为只以藻类为食⁴¹在美国，最近对泰勒谷的冯格拉德流进行的一项研究使用同位素C和N比值表明，而p . murrayi，缓步动物(例如，答:antarcticus strain)，轮虫可能只吃微生物，大肠antarcticus strain食物来源可以由上述微型无脊椎动物组成，而不是藻类或除了藻类⁴²．然而，这些微型无脊椎动物的确切食物来源和肠道微生物群还没有被研究过，因此限制了对它们在生态系统中的作用的充分理解。

在这项研究中，我们描述了线虫和缓步动物肠道微生物群，以及可能在其组装结构中发挥作用的潜在因素(例如，环境，如溪流身份和垫类类型或宿主特异性因素，如宿主身份)。由于这个南极生态系统支持一个非常简化和形态上易于控制的微型无脊椎动物群落，因此在自然环境条件下，可以在线虫物种水平上研究肠道微生物组的组装模式。除了描述肠道微生物群的细菌成分外，我们还检查了宿主相关的微生物真核生物。我们假设，所有微型无脊椎动物的肠道微生物群落主要是由宿主身份而不是环境因素来解释的，因此在黑色和橙色垫层以及所有河流中都是一致的。因此，所有与宿主相关的微生物群落(即细菌和真核生物)将不同于垫子上的微生物群落，也不同于彼此。

社区之间的Alpha多样性差异

线虫肠道微生物群落划分为各自的种类大肠antarcticus strain而且p . murrayi基于18S与形态学一致的宿主数据(见方法)Microinvertebrate单”)。相比之下，由于恢复了三种无法识别的18S缓步动物单倍型，肠道微生物群落被分配给缓步动物。Mat细菌群落显著(Tukey's HSD，P< 2e−16)在所有四个alpha多样性指标(即丰富度、香农指数、辛普森指数和Faith的系统发育多样性)测试中，都比所有微型无脊椎动物肠道微生物群落的多样性更丰富(图2)。2，补充表S1)．相对于群落类型(即mat)的意义，大肠antarcticus strain，p . murrayi，缓步动物)的所有alpha多样性指标(GLM，P< 0.001， χ²(3) > 58.21)，垫型(P> 0.65， χ²(1)对细菌α多样性的影响< 0.21，而流对Shannon指数和Simpson指数的影响显著(P< 0.01， χ²(3) > 11.47)但不是财富或信仰的PD (P> 0.38， χ²(3) < 3.07)(补充表S1)．社区类型与河流之间的相互作用也很显著(P< 0.001， χ²(9) > 23.59)的所有测试指标(补充表S1a).肠道微生物群大肠antarcticus strain而且p . murrayi的多样性较低(补充表S1b)对于Shannon的PD, rich和Faith的PD (Tukey HSD，P< 0.05)，但Simpson 's (Tukey HSD，P> 0.39)。虽然在丰富度、Faith的PD和Simpson的肠道微生物群落之间的α多样性没有差异，但Shannon指数表明肠道群落的α多样性大肠antarcticus strain是最不多样化的(P< 0.05，图;2)．

在微型无脊椎动物中，大多数真核生物reads可预测地分配给宿主(89.25%)大肠antarcticus strain， 99.10%为p . murrayi， 99.45%的缓步虫)，但当去除后，有足够的覆盖率和测序深度用于进一步分析非寄主真核生物群落。Mat真核生物群落在所有指标上都比所有非宿主真核生物肠道群落更多样化(Tukey HSD, rich, Shannon 's和Faith 's PD)，P< 1.884 e−05;辛普森P= 0.09)(补充表S2)．真核生物α多样性仅在Shannon’s (GLM，P= 0.06， χ²(1) = 3.57)，但富贵、辛普森和Faith的PD (P> 0.15, x²(1) < 2.10。其中，“富有”和“信仰”的PD差异显著(P= 0.02， χ²(3) > 9.82，补充表S2a)， Canada Stream更加多样化(Tukey HSD，P< 0.05)，但香农氏(P= 0.22)或辛普森指数(P= 0.12)(补充表S2)．与细菌多样性相似，Shannon指数表明非寄主真核生物群落大肠antarcticus strain最不多元化的是p . murrayi，然后是缓步动物(Tukey HSD，P< 0.05)2b).对于丰富，所有肠道微生物群落的多样性都类似于垫子，而Faith的PD显示了对丰富的意义重叠大肠antarcticus strain另外两个微型无脊椎动物群落p . murrayi和缓步动物确实分开了(Tukey HSD，P< 0.05)(补充表S2)．

细菌群落组成的差异

黑色和橙色的垫子代表了两种不同的微生物群落。只检查垫子，尽管两种垫子类型(PERMANOVA，P< 0.003,F(1) = 3.94)和流(P< 0.003,F(3) = 4.04)显著影响细菌群落组成，群落以垫型为主(补充图;S1a)，只有加拿大河流社区与其他河流社区分开(补充图。S1b).因此，与垫型(10%)相比，流型解释了最大的变化(32%)(补充表)S3a)尽管所有其他流在NMDS空间重叠(补充图。S1b).相比之下，微型无脊椎动物的肠道微生物群落不按垫型聚类(补充图。S2A)也不是通过流，而是通过主机标识(例如，大肠antarcticus strain，p . murrayi，缓步动物)(补充图S2b).尽管所有被调查的因素都显著影响肠道微生物组组成(PERMANOVA，P< 0.05,F(1-6) > 0.48)，席型和流型分别只能解释1%和4%的微生物群落变异(补充表S4a).相比之下，宿主身份在肠道微生物群的组装中起着最主要的作用，解释了总变异的14%。然而，大多数变异(72%)仍然无法解释。在分类分辨率的属水平上，缓步动物内75%的分类单元，在p . murrayi87%的人大肠antarcticus strain与垫子共享。肠道类群的剩余比例没有在任何垫子中发现，但在所有样本中都处于低丰度。黑色和橙色垫子占asv的40%，27%的独特asv分配给黑色垫子，33%分配给橙色垫子。然而，在属水平上，在两种垫子类型中都观察到71%的属，黑色垫子中有17%的独特属，橙色垫子中有13%的独特属。

蓝藻门、拟杆菌门和变形菌门是所有微生物群落中最丰富的门，占总群落组成的86.40%(图4)。3.a，补充表S5a).指示种分析证实，蓝藻门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria)是四种微生物群落类型的显著指示门。在席菌群落中，蓝藻是最具指示性的门，尽管还有其他六个指示性门(补充表)S6)，累积相对丰度较低(< 1.2%)。变形菌门是小鼠肠道微生物群的唯一指示门大肠antarcticus strain．相比之下，拟杆菌是唯一的指示门肠道微生物群p . murrayi也表明了缓步动物的存在。虽然patescibacterium也可以指示缓步动物，但它在所有微生物群落中的比例小于0.1%，在缓步动物肠道微生物群落中的比例小于0.28%。掠食性细菌门，Bdellovibrionota，在所有肠道类型(1.02%)中富集(0.2%)。由于它们在群落中所占的比例都很高，而且它们作为指示物种的意义也很大，因此我们选择了三个最丰富的门的分类群进行进一步的分析。

垫层类型对三个优势菌门的相对丰度没有影响，但群落类型(GLMM，P< 1.39e−15，χ²(3) > 72.28，补充表S7a).溪流显著影响蓝藻和拟杆菌(Bacteroidota)的丰度(P< 0.001， χ²(3) > 14.98)，但Proteobacteria (P= 0.11， χ²(3) = 5.93。对于蓝藻来说，这两种垫类以相似的总体相对丰度为主(黑色和橙色分别为48%和45%，图。3.a，补充表S5A)，但橙色垫子的含量多70.8%Phormidium,而黑色垫子则多含87.2%念珠藻属(无花果。3.b、补充表S5b).与垫垫相比，所有微型无脊椎动物肠道微生物群落的蓝藻都显著减少(图。3.b)彼此比较时含有相似数量的蓝藻。蓝藻的贡献念珠藻属从两种垫子类型的平均19.2%下降到肠道微生物群的0.2%。蓝藻虽然Tychonema一个数量级比念珠藻属在肠道微生物群中，其相对丰度在所有垫层(7.5%)中是肠道(3.4%)的两倍多。

与草席相比，肠道微生物群落p . murrayi和缓步类，但不是大肠antarcticus strain，在拟杆菌(Tukey’s HSD，P< 0.05)(图3.c、补充表S5a).尽管两者的肠道微生物群p . murrayi在门水平上，拟杆菌门的相对丰度与缓步纲相似，在属水平上，缓步纲微生物类群与垫类相似，但相对丰度较大。相比之下，肠道微生物群p . murrayi与垫子和缓步动物不同，并显著增加了单一属Larkinella占其肠道群落的37%，而所有其他微生物类型的0.03%(图2)。3.c、补充表S5b).与缓步动物相比，p . murrayi和mat，都含有相似的变形菌群，肠道微生物群落大肠antarcticus显著富集(Tukey HSD，P变形菌门(Proteobacteria)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的差异均< 0.05。3.d).其他感兴趣的变形菌门大肠antarcticu其中包括立克次科的分类群，这个科以其细胞内共生体而闻名。沃尔巴克氏体属在美国，任何微生物组中都没有一种众所周知的胞内细菌。Comamonadaceae是变形菌门在所有菌种中数量最多的科(97.91%)Polaromonas。

线性判别分析效应量算法(LEfSe)证实并进一步细化了这些组成结果。LEfSe在不同的分类等级上共鉴定出49个独特的分类单元，特别是受四种群落类型(即垫类、大肠antarcticus strain，p . murrayi，缓步动物)(LDA效应值= 4，P< 0.05)(图4)，但在测试溪流(Canada, Bowles Creek, Delta, Von Guerard)或席状类型(黑色或橙色)时，没有明显的分类群。蓝藻(门)和蓝藻(纲)是与席菌群最相关的两个类群，而变形菌门(门)和γ -变形菌门(亚门)与席菌群最相关大肠antarcticus strain(无花果。4b). Acidobacteriota和Planctomycetota是另两个指示门大肠antarcticus strain但效果值较低。相比之下，没有门水平的特征类群p . murrayi也没有缓步动物肠道微生物群。相反，最重要的分类群p . murrayi肠道菌群为噬细胞菌目、螺旋体菌科和Larkinella(属)(无花果。4b)，均突出分类学上的一致性，以Cytophagales和Spirosomaceae为目和科Larkinella．缓步虫宿主中5个最显著的类群都是拟杆菌门(纲)，没有一个类群显著高于目水平(图2)。4b).突出营养级相似性，为指示类群p . murrayi缓步动物除一个分类单元外均属于同一纲(即拟杆菌门)。然而，所有指示类群在目、科和属水平上都是寄主特异性的。在所有组的指示性细菌类群中，在整个细菌树中观察到很少的宿主类型重叠(图2)。4A)，一个宿主微生物组的49个类群中只有5个嵌套在另一个宿主微生物组中。

垫子和微型无脊椎动物中明显不同的微生物群落也得到了对其功能特征的初步预测的支持。利用PICRUSt2，对席类群落的功能剖面进行了分析。S3)主要根据垫子类型(PERMANOVA，P= 0.04,F(1) = 2.76)， stream (P= 0.07,F(3) = 1.79)，但流解释了模型中两倍以上的变化(21.2% vs 10.9%)。与细菌组成数据相似，微型无脊椎动物肠道微生物组功能概况(补充图。S4)因宿主身份的不同而有统计学差异(PERMANOVA，P< 0.01,F(2) = 21.10)，垫式(P= 0.04,F(1) = 2.16)， stream (P< 0.01,F(3) = 8.60。然而，宿主身份是功能剖面中最重要的因素，因为它比垫型(< 0.1%)或流型(7.2%)解释了更多的变异(12.9%)。

真核生物群落的组成差异

真核垫类群落以缓步动物、轮虫、线虫和藻类为主(补充图。S5)．研究垫的真核组成，垫类型之间存在显著差异(PERMANOVA，P= 0.03,F(1) = 2.37)和各流之间(P< 0.001,F(3) = 6.18)，但流型(40.7%)比席型(5.2%)解释的变异量大得多(补充表)S3b).加拿大流对席类群落特别重要，占整个流解释变化的一半，突出了该地区席类的独特性。不同类型的微无脊椎动物非寄主真核生物群落组成差异不同。虽然流、垫型和宿主型对非宿主真核肠道群落的影响均具有统计学意义(P< 0.001,F(1-3) > 1.78)，与细菌群落相似，宿主身份对变异的解释最多(3.7%)，其次是流(2.5%)和垫型(0.8%)(补充表)S4b).指示种分析表明，后生动物(Metazoa)和叶绿体(Chloroplastida)与席类群落有关(P< 0.001, r²= 0.69和0.43)，而三种微型无脊椎动物的真菌(P< 0.001, r²= 0.69)，在分类等级的王国级。

在微型无脊椎动物肠道群落中，真菌构成了每个微生物组中最大的组成部分(67.3%)，其次是微生物真核生物(包括SAR超群)和后生动物(补充图)。S5)．与垫子相比，所有的微型无脊椎动物肠道微生物群落都显著增加(Tukey HSD，P< 3.54e−07)富集于真菌(分别为3.3% vs. 48.9-78.5%)(补充图;S5B)，导致整体群落组成发生相应变化。真菌的相对丰度大肠antarcticus strain显著降低(P< 0.01)p . murrayi缓步动物(分别为48.9%、76.7%、78.5%)。S5b).与草席类型相比，溪流影响肠道内真菌的丰度(GLMM，P= 0.03， χ²(3) = 9.00，补充表S7)．与草垫相比，所有肠道微生物群落都以Pezizomycotina亚门为主，而Blastocladiomycota (Tukey HSD，P< 0.05)(补充图S5b). Eurotiomycetes和Leotiomycetes是真菌类群中数量最多的(15.7%和9.5%)，所有无脊椎微动物肠道真菌群落都具有高度多样性的类群，且组成相似。

群落类型间后生动物的相对丰度差异显著(GLMM，P< 0.01， χ²(3) = 84.74)，但对垫层类型和流场均无显著影响(P> 0.47， χ²(1,3) < 2.51，补充表S7c).非寄主后生动物asv在肠道微生物组中明显更常见大肠antarcticus strain比p . antarcticus strain缓步动物(Tukey HSD，P< 0.001，补充图。S5一个)。大肠antarcticus strain真核生物群落以缓步类(22.9%)和轮虫类(5.2%)为主。S5c).有趣的是，在所有微型无脊椎动物肠道中检测到轮虫asv的相对丰度相似(Tukey HSD，P> 0.32)。p . murrayi仅在一个标本中检测到Reads大肠antarcticus strain在94个缓步动物样本中，有7个是如此p . murrayiReads丰度极低(< 0.1%)．没有阅读大肠antarcticus strain在内脏中发现的p . murrayi也不是缓步动物。

Microinvertebrate单

正如所料,大肠antarcticus strain而且p . murrayi宿主18S ASV数据显示，所有样本中每一种均为单一种。然而，宿主18S ASV数据表明，可能存在三种分子单倍型缓步动物，它们都与已知的干谷缓步动物(可能是Hypsibiidae)具有相同的分配Acutuncus antarcticus strain或MacrobiotidaeRichtersius而且Paramacrobiotus，或MilnesiidaeMilnesium)．测试的alpha多样性指标和三个主要细菌门(即蓝藻门、变形菌门、拟杆菌门)的相对丰度在三个单倍型(GLM、GLMM、P> 0.43， χ²(2) < 4.21)S6)．尽管整体细菌群落组成在统计学上确实存在差异，流型和单倍型分别解释了9.9%和8.1%的变异，但它们在NMDS空间中完全重叠(补充图)。S7)．因此，由于单倍型身份不明，本研究将三种可能的宿主单倍型组合在一起。

我们的研究扩大了线虫和缓步动物肠道微生物群的系统发育范围，并为它们组装的特定因素的意义提供了新的见解。虽然许多动物都有明确的微生物群落，但这种模式并不普遍。相反，肠道微生物群落可能是周围环境的反映，是随机的，甚至是没有的⁵．鉴于迄今为止所描述的线虫和缓步动物微生物群的数量有限，哪些因素可能驱动它们的肠道组装一直难以预测。由于线虫和缓步动物在生态系统功能中的重要性¹⁶在美国，研究来自不同栖息地的广泛宿主是至关重要的。

正如我们假设的那样，与环境因素(如垫子类型、溪流)相比，宿主身份更能解释微型无脊椎动物肠道微生物群。我们观察到，所有肠道微生物群落的多样性都较低，并且在细菌和真核生物组分上与它们所居住环境的微生物群落不同。在粗略的分类分辨率(门)水平上，指标分析和相对丰度的统计检验表明，菌食性微生物群落p . murrayi缓步动物也很相似，两者都明显不同于杂食性动物大肠antarcticus strain这可能表明饲养性状对肠道微生物群的组装有一定作用。然而，在更精细的分类分辨率水平上，LEfSe算法和相对丰度的目、科和属表明，宿主身份是线虫和缓步动物肠道微生物群落组装的最主要因素。虽然也观察到环境因素的潜在作用(例如，垫的类型和河流)，但这些因素解释的变化比所有三种微型无脊椎动物的身份更少。这些结果在很大程度上与文献一致秀丽隐杆线虫这表明存在一种相对独立于周围底物的保守肠道微生物群²⁵．有趣的是，之前描述的内脏秀丽隐杆线虫都被变形菌门所主导²⁵而不是主宰肠道的拟杆菌p . murrayi检查在这里。虽然这两种线虫都是食菌动物，但它们不同的栖息地偏好(腐烂的水果vs.水生蓝藻垫)以及可能的系统发育位置(Rhabditida vs. Plectida)在肠道微生物群的组装中可能比进食特征更重要。然而，变形菌门仍然是细菌的主要组成部分p . murrayi微生物组。变形菌门也是杂食性动物肠道的主要组成部分e . antarcticus strain类似于对陆地杂食性线虫的唯一其他研究Dorylaimus stagnalis⁴³这表明它对整个线虫门可能很重要。缓步动物肠道微生物群在拟杆菌门和变形杆菌门中都比以前的报道更丰富^26，27提示这两个细菌门在线虫和缓步动物肠道微生物群中的功能作用。黄杆菌属而且Ferruginibacter在所有微生物群落中，是否有两个最丰富的拟杆菌属，就像在其他南极缓步动物中观察到的那样²⁶特别是饱食(即不是饥饿)的南极缓步动物^30.这表明它是一种重复出现的食物来源。有趣的是，LEfSe算法没有识别门水平的意义p . murrayi或者缓步动物，但它确实大肠antarcticus strain．这支持了大肠antarcticus strain作为一种杂食动物，不仅以广泛的食物类别(即真菌，细菌，藻类，微后生动物)为食，而且作为每个喂养类别中的分类单元的通才喂食(即许多类型的细菌)。然而,个人大肠antarcticus strain比所有其他微型无脊椎动物的多样性都要低，这表明尽管一个种群的大肠antarcticus strain可以以广泛的类群为食，个体则不行。

“宿主身份”的抽象可能涉及一系列物种特异性因素，这些因素共同影响肠道微生物群的组装。例如，尽管许多线虫和缓步动物通常在科或属水平上被归类为食菌动物，但物种特有的摄食习惯⁴⁴可能会对肠道微生物群组合施加选择性压力。这可以解释为，肠道微生物群的任何潜在成分都必须首先通过动物的口腔，这可能是针对某些细菌分类群的选择性屏障，动物气孔的大小施加了一层选择，以防止太大的细菌进入口腔和消化系统。更容易摄入较小的细菌秀丽隐杆线虫^45，46，47会支持这个观点。同样，耗损大的尺寸念珠藻属(每个细菌直径约4 μm⁴⁸在我们的研究中，所有的微型无脊椎动物肠道中2 cm - 20 cm)的气孔尺寸都很小(直径约3 μm)p . murrayi⁴⁹)，尽管尚不清楚是否大肠antarcticus strain可以用齿尖刺穿较大的细胞。线虫的食道形态也可能在肠道中发挥作用，而不是简单地通过线虫。例如TEM成像秀丽隐杆线虫而且p .面培养在大肠杆菌显示破碎和未破碎大肠杆菌细胞，分别由于食道研磨机的存在和不存在⁵⁰．自p . murrayi含有食道研磨机，任何能够在肠道定植的细菌必须是小的和/或有足够的抗性，以通过这一浸渍步骤保持活力。

除了形态约束导致的群落过滤外，行为因素也可能很重要。例如，使用食物偏好分析，已经表明秀丽隐杆线虫能区分高质量和低质量(C:N比)细菌吗⁴⁶．这种区分其细菌食物来源质量的能力甚至在不能以细菌为食的线虫(例如，植物寄生线虫)身上也被观察到。⁵¹这表明食物质量感知是所有线虫微生物群落都要考虑的一个重要因素。然而，重要的是要记住，线虫可以在不定植肠道的细菌上培养。其他不为人知的行为因素也可能起作用。例如,Plectus来自南极海岸线的物种表现出以变形菌为食的偏好Polaromonas⁵²，是我们在所有微型无脊椎动物和席类中观察到的最丰富的科。此外,Polaromonas之前在南极缓步动物微生物群落中有过报道吗^30.，这表明Polaromonas可能是南极微型无脊椎动物的常见食物来源。不幸的是，除了少量的摄食实验研究外，我们对大多数线虫和缓步动物的实际摄食偏好知之甚少，这阻碍了我们对它们在生态系统功能中的作用的理解。肠道微生物组研究提供了一种新的机制，可以方便地扩展这一知识，就像对其他动物所做的那样⁵³．

并不是所有进入线虫或缓步动物肠道的细菌都能在宿主体内定植，相反，一些细菌可能只是短暂的内容物。虽然在方法上很难区分这两者，但已经表明秀丽隐杆线虫在自然环境中建立了不同的微生物群落，即使转移到培养环境中也能保持其肠道微生物群落大肠杆菌^20.这表明，一旦建立，线虫肠道微生物群落可以稳定并抵抗变化。有趣的是，一小部分肠道微生物类群在垫子中缺失(13%属在垫子中)大肠antarcticus strain， 22%p . murrayi(25%的缓步动物)，尽管它们都是低丰度和共同门。然而，它们在席子中缺乏存在可能是由于席子样本的分析数量(24)低于肠道样本(251)。总体而言，本研究中的所有微型无脊椎动物物种都表现出物种特异性的细菌微生物群，在溪流和垫层之间几乎没有变化，这表明本研究中检测的肠道群落是由实际的常驻微生物组成的，但这一领域的进一步研究是有必要的。

沃尔巴克氏体属这是一种常见的细胞内寄生虫，有时在线虫和缓步动物中被报道²⁸在这项研究中没有在任何微型无脊椎动物内脏中发现。然而，在立克次科的姐妹家族中检测到其他细胞内细菌，尽管丰度非常低。我们还观察到Larkinella其中Sp.含量最高，也最能说明细菌的存在p . murrayi勇气。关于该属的功能知之甚少，但分离出的细胞生长成粉红色的马蹄形细胞⁵⁴这为未来的体外研究提供了可能。然而，目前，任何可能的共生功能或原因Larkinella可能就这样充实了吧p . murrayi内脏是未知的。

本研究中采样的三种微型无脊椎动物都含有真核肠道微生物群，主要由真菌组成。真菌菌群(即真菌菌群)在海洋线虫中仅报道过一次³²还有一次是缓步动物^30.这两个结果都表明真菌群落发育良好。我们的数据显示，所有宿主中真菌asv最丰富的是子囊菌类群，如Tetracladium furcatum和Pyronemataceae，这两种水生真菌都以溪流中的分解物质为食。而杂食性线虫的微生物组中存在真菌(大肠antarcticus strain)并不奇怪，有趣的是，假定的细菌喂养p . murrayi真菌含量比杂食动物高。这可能表明，以前分配的线虫喂养类别可能不能反映线虫在生态系统中的确切功能角色p . murrayi似乎在摄入真菌，即使它没有从真菌中获得营养。有趣的是，所有微型无脊椎动物肠道之间的真菌群落大多相似，但与之前从意大利冰川中记录的缓步动物真菌群落不同^30.这暗示了社区集会可能在地理上的作用。在我们对非宿主真核生物肠道内容物的分析中，我们发现了支持这种假设的证据大肠antarcticus strain作为这个生态系统中唯一的杂食/捕食者。其肠道微生物组的特征是后生动物asv相对丰度最高，主要来自缓步动物和轮虫。虽然两p . murrayi缓步动物确实含有相对较少的其他后生动物，尤其是轮虫，这很可能是过滤破碎细胞中自由漂浮的DNA的结果，而不是直接捕食的结果。此外，阴性对照中没有污染的证据。大量的p . murrayi在单个中观察到的读大肠antarcticus strain肠道可以表明大肠antarcticus strain可能不始终以其他线虫为食，但保持这样做的能力。

虽然在本研究中，宿主身份解释了微生物组变异的最大比例，但大多数变异仍然无法解释，这表明其他因素可能起作用，包括非生物环境因素、随机性、生物地理或微生物组间的相互作用。之前的研究秀丽隐杆线虫肠道内存在细菌间竞争⁵⁵，底物多样性较大，导致随机肠道微生物群较少^56，57．尽管如此，我们表明，相对于测量的环境因素，宿主身份(而不是摄食特征)可能是形成生活在南极干谷溪流中的线虫和缓步动物肠道微生物群的更重要因素之一。尽管覆盖范围有限，但PICRUSt2中提到的功能特征与组成独特的微生物群落一致，表明它们在这个生态系统中具有不同的功能作用。然而，已经观察到线虫宿主身份的不同影响，因此为了确认宿主身份的作用和任何功能作用，需要使用来自不同地理位置的更广泛的物种进行额外的研究。

线虫和缓步动物肠道微生物群只在少数物种中被描述，不足以代表这些门内广泛的系统发育和营养多样性。在这些研究中，研究这些微生物群落组成的原因的研究就更少了。利用南极干谷溪流的蓝藻垫作为自然生态系统模型，我们能够证明生活在这些垫中的线虫和缓步动物的肠道微生物群落彼此不同，也与它们所居住的周围微生物群落不同。虽然在细菌门水平，相似的营养水平(细菌喂养)，但系统发育不同的微型无脊椎动物(p . murrayi和缓步动物)有更多相似的微生物群，而不是系统发育上更接近的两种(p . murrayi而且大肠antarcticus strain)，但在不同的营养级别(细菌和杂食)线虫，在更精确的分类级别上，宿主身份是最重要的组装因素。然而，需要对代表营养和系统发育多样性的其他物种进行检查才能完全支持这一观点。

样本采集和DNA处理

蓝藻垫从四个季节性活跃的溪流中收集(1;加拿大,2。鲍尔斯溪，3岁。δ4。Von Guerard)在南极洲泰勒谷的Fryxell湖盆地(77°36′21″S 163°07′32″E)(图。1)．河流长度从0.49 km (Bowles Creek)到5.89 km (Delta Stream)不等，平均长度为3.2±2.3 km。加拿大河和鲍尔斯河都源于阿斯加德山脉内的加拿大冰川，而三角洲河和冯·格拉德河则源于库克里山脉内的冰川。在每条河流中，一个具有代表性的圆形地块(半径2米)，有“黑色”和“橙色”垫子类型，随机选择任何流量仪表的上游。2019年1月，采用无菌手术刀切下1个7 cm × 7 cm的垫片，分别放入100 mL无菌玻璃瓶中，共采集24份垫片样品(4个流× 2个垫片× 3个重复)。样品在- 20°C冷冻，运输到佛罗里达大学，并在- 20°C保存，直到加工。垫子慢慢解冻至4°C(每24小时增加10°C)，并在无菌培养皿中在解剖显微镜下检查。微型无脊椎动物个体Eudorylaimus antarcticus strain(n = 88)(目前正在重新评估分类学)，Plectus murrayi(n = 176)，缓步动物(n = 94)用金属镐收集，然后用物理移动和搅动冷水洗涤3次。以前的研究已经建立了类似的过程来有效地去除外部附着的微生物^22，32．洗涤后，将单个微型无脊椎动物置于含有25 μL裂解缓冲液(800 μg/mL蛋白酶K, 0.2 M NaCl, 0.2 M Tris-HCL pH 8.0, 1% β -巯基乙醇)的250 μL微离心管中。⁵⁸．在解剖镜下检查试管，以确认只有一个微型无脊椎动物被放入裂解缓冲液中。以同样的方法制备不含任何微型无脊椎动物的裂解缓冲液阴性对照管(n = 7)。通过65°C孵育管120 min提取总宿主和微生物组DNA，以最大限度地提高蛋白酶K酶的活性，然后在100°C孵育10 min使其失活。根据制造商的协议，使用DNeasy PowerSoil Kit (QIAGEN)从300 μL混合垫料浆中提取底物垫DNA。利用高通量元条形码技术，对存在于微型无脊椎动物个体及其基质中的细菌和真核微生物群落进行了表征。采用来自Earth Microbiome Project的引物和PCR条件扩增16S (515F/926R)和18S (1391f./EukBr) rRNA基因标记⁵⁹(补充方法S1)．对PCR产物进行凝胶电泳观察，确认扩增成功。聚合3个PCR重复(每个PCR重复使用1μL DNA模板扩增)，并将其与阴性对照一起发送至新罕布什尔大学Hubbard基因组研究中心，用于附加指标(使用Golay条形码)⁵⁹，文库制备，并在Illumina HiSeq 2500 (2 × 250 bp) (Illumina Inc.， CA, USA)上配对测序。

生物信息学和社区处理

在测序设备进行读解复用之后，读的处理使用QIIME2完成⁶⁰．首先，使用cutadapt去除适配器和引物序列⁶¹在QIIME2中使用quality-filter插件进行质量过滤，通过删除平均质量分数低于30的碱基对来修剪读取。由于质量过滤后长度不足，反向16S读取被丢弃，未配对的正向读取(196 bp)被去噪，使用DADA2管道创建100%相似的asv⁶²．在加入DADA2之前，将正向和反向18S读取量削减到125 bp，以创建平均长度为131 bp，最大长度为172 bp的100% asv。对于两种管道，使用内置的DADA2算法去除嵌合体⁶²．在QIIME1.9中使用assign_taxonomy.py脚本和BLAST将分类法分配给每个ASV⁶³，将16S的SILVA v138数据库和18S的SILVA v111数据库进行比较，过滤掉所有被识别为“未培养”的参考序列⁶⁴．团体过滤使用phyloseq包⁶⁵．去除16S ASV表中的非细菌序列和18S ASV表中的非真核生物序列。此外，命中特定微型无脊椎动物宿主的18S序列仅从该宿主的ASV表中删除，分配差的18S ASV(即查询覆盖率低于90%和ID低于95%)从所有宿主中删除。从实验样品中减去阴性对照中鉴定出的序列。由于蓝藻演化支的不确定性Phormidum / Phormidesmis^66，67，68，指定阅读Phormidesmis被分配到Phormidium．最后，根据达到水平渐近线的物种稀疏曲线，丢弃16S reads总数小于100和18S reads总数小于100的样本。此外，9个额外的样品大肠antarcticus strain作为异常低多样性的极端异常值被移除。经过处理和过滤，共从251种微型无脊椎动物(52种)中回收了4,233,899个细菌reads和1,040,761个真核生物reads大肠antarcticus strain110美元p . murrayi缓步动物为89个)和24个垫子样本。为简单起见，我们将“微生物组”定义为样品中整个检测到的微生物群落，但认识到进一步的研究可能会区分肠道内的常驻生物和短暂生物。

统计和可视化

在R版本3.6.1中进行统计⁶⁹（http://www.r-project.org)．Alpha多样性指标(即ASV丰富度、Simpson’s、Shannon’s和Faith’s系统发育多样性)使用Hill number计算hill_taxa从hillR包⁷⁰．社区类型的影响(mat，大肠antarcticus strain，p . murrayi使用相同的具有标准正态分布的通用线性模型(GLM) (AlphaDiversityMetric ~ Community* mat *Stream)对alpha多样性的不同测量方法进行了测试。用P和χ对模型检验变量的显著性进行评价²使用II型平方和方差分析。所有的模型都是建立在精度和选择的基础上，用DHARMa包检查残差⁷¹．Tukey的HSD被用来比较不同社区的宿主身份之间的显著性(例如，黑垫与p . murrayi来自橙色垫子的缓步动物，与来自黑色垫子的缓步动物相比)。为了更准确地评估其重要性(R²)，并使用置换方差分析(PERMANOVA)对每组进行测试阿多尼斯函数素食主义者2.5 7⁷²，显著性用P和F值。垫类的PERMANOVA使用(DistanceMatrix ~ Mat*Stream)运行，微型无脊椎动物的PERMANOVA使用(DistanceMatrix ~ HostID*Mat*Stream)运行。排序可视化使用NMDS排序图与距离函数内phyloseq⁶⁵．广义线性混合模型(glmm)glmmTMB从glmmTMB进行了包装，以测试溪流(加拿大，Bowles Creek, Delta, Von Guerard)，垫类(黑色，橙色)，群落类型(垫，大肠antarcticus strain，p . murrayi(缓步动物)，以及它们对所选细菌门和属相对丰度的相互作用，所有因素都是固定效应，流是额外的随机效应，以及beta分布，以解释过度分散⁷³(RelativeAbundance ~社区*垫+垫*流+社区*流+(1|流))。用P和χ对GLMM模型检验变量的显著性进行评价²．为了在门水平上确定对微生物群落最重要的类群，采用了指示种分析方法indicspecies包装有9999种排列⁷⁴．此外，线性判别分析效应量(LEfSe)被执行到属水平⁷⁵．LEfSe算法在数学上(Kruskal-Wallis和秩检验)识别特征分类群P< 0.05)，并通过一致性评估(未配对Wilcoxon秩和检验)提供生物学信息P< 0.05)和效应量(LDA)⁷⁵．LEfSe提供了微生物群落的分类排序检查，这是其他统计工具无法做到的，例如，LEfSe可以突出显示宿主微生物组的科，但不能突出其中的属或上面的目。在我们的分析中，我们在Huttenhower lab Galaxy服务器上使用一个对所有方法和默认LEfSe参数应用了一个LDA效应值为4的分数⁷⁵（https://huttenhower.sph.harvard.edu/)．LEfSe的分支图是从Huttenhower实验室Galaxy服务器中导出的，并在Adobe illustrator中进行了修改以使其清晰。使用PICRUSt2对微生物群落中的功能谱进行初步预测⁷⁶并使用上述的PERMANOVA方程进行测试，但由于使用扩增子数据预测函数的局限性，这不是本研究的重点⁷⁷以及有限的南极细菌基因组数据库。使用ArcGIS创建采样地图。所有其他图形都是用R创建的ggplot2．