非线性超声定位显微镜定量组织灌注成像gydF4y2Ba

超声是一种强大的、广泛使用的成像方式，在测量血流方面有着悠久的历史。超声在临床和临床前成像方面有几个优势;值得注意的是，在纵向研究中，它的实时功能提供了一种非侵入性、经济的工具来评估结构组织和血流变化。新的多普勒方法已经能够在较小的血管中可视化低速血流gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．然而，当多普勒频移从低速血流与组织运动的血流重叠时，包括微循环灌注(大多数情况下< 1cm /s)在内的小血管血流的可视化就丢失了。为了克服这一点，对比增强超声成像(CEUS)利用静脉注射微米级气体造影剂来分离和观察组织灌注gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．基于循环微泡对超声的非线性响应，可以以速度无关的方式将其信号从周围组织中分离出来，从而无需依赖基于速度的壁过滤方法即可获得流经整个血管树的血液流动。然而，由于微气泡在高发射频率下的振荡响应减小，CEUS仍然需要在穿透深度、灵敏度和空间分辨率之间进行权衡gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

最近，从光学显微镜借来的技术被应用于制作超分辨率的血管图，打破了空间分辨率的经典“衍射极限”(gydF4y2Ba\ \ (sim \)gydF4y2Ba100um在15mhz)gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}．这种方法被称为超声定位显微镜(ULM)，本质上包括空间离散循环微泡造影剂的定位和随后的帧间跟踪gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．超分辨率血管图是通过长时间采集(几十秒到几分钟)积累这些轨迹而产生的。数据通常使用平面波成像(通常gydF4y2Ba\ \ (sim \)gydF4y2Ba角度复合后的500-1000 Hz帧率)，以改善微泡跟踪并最小化所需的总采集持续时间gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

与传统的超声造影相比，目前的ULM方法使用线性脉冲方案，这需要时空滤波从组织背景中分离流动的微泡。然而，由于最慢的微泡与组织运动的速度重叠，这些气泡被丢弃，阻碍了在组织灌注水平上研究血液流动gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．在这项工作中，我们通过使用平面波，非线性脉冲方案来克服这一限制，从组织背景中分离出与速度无关的微泡信号gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．然后，我们能够分离最慢的移动微气泡使用奇异值分解(SVD)产生微循环的ULM图像。在这里，我们使用大鼠脊髓作为模型系统，挫伤损伤作为病理性血流动力学破坏的现实例子。除了产生微循环的超分辨率图像外，定量微泡轨迹参数(如轨迹长度、持续时间、速度)代表了一种新的特征集，可以描述微循环流动的相对质量。gydF4y2Ba

非线性ULM在大血管成像方面优于超声多普勒gydF4y2Ba

即使在固定和麻醉大鼠，脊髓也表现出心脏和呼吸运动。为了证明ULM在啮齿动物脊髓中的可行性和实用性，将ULM成像与非线性多普勒成像进行了比较gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba完整胸椎脊髓(T8-T9)的对比结果。ULM大大改善了相邻血管之间的分离，能够更准确地量化血管直径。血管直径定义为整个血管剖面的全宽半最大值(FWHM);平均而言，对于匹配的血管，ULM获得的直径大约是多普勒获得的直径的三分之一(36.1±6.77 um vs. 120±11.2 um)。此外，ULM分离了两根重叠且在多普勒图像中无法区分的血管(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA，红色椭圆)。与多普勒图像相比，完整的ULM图像的空间分辨率增加了3倍(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c);放大后的血管分段(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bad,e)以比多普勒等效分辨率高5倍的分辨率进行处理(每像素5 um vs. 25 um)。这些结果表明，这里应用的累积位移运动校正算法足以实现高质量的ULM成像的啮齿动物脊髓。gydF4y2Ba

非线性ULM与线性ULM在大血管成像中的比较gydF4y2Ba

在一个大血管成像案例中，将非线性ULM直接与线性ULM进行比较。数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba描述一个在完整的胸椎脊髓中获得的代表性例子。线性和非线性ULM图像都是由相同的采集产生的，其中一种是将所有脉冲相加以保留线性信号分量(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa)或用半幅脉冲减去组织抵消(非线性，图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).非线性ULM通常会导致更好的分辨率，特别是在最小的容器中。这在图中放大的区域中得到了最清楚的说明。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba氟;非线性ULM解决了一些常规ULM无法解决的血管，在非线性情况下，那些在两种情况下都能解决的血管表现出明显的FWHM减小(图中35.0±5.69 um vs. 46.0±8.89 um)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba氟)。这可能是由于与基本信号相比，谐波信号分量的点扩散函数较小，从而减少了定位误差。虽然线性ULM可以很好地描绘脊髓血管系统，但非线性ULM在某些区域比传统方法在视觉上有明显的改进。这些结果主要表明，常规ULM和非线性ULM对于大血管成像的能力相同，在非线性情况下具有适度的优势。gydF4y2Ba

基于特征的流量分割可以访问组织灌注gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba描述了功率多普勒图像，显示了组织杂波和微循环流与线性成像之间的重叠(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa、c);利用非线性成像可以恢复组织灌注信号(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, d)。基于同样的原理，非线性成像与ULM处理相结合，为组织灌注成像提供了一种新的方法。用于非线性ULM的平面波调幅脉冲方案消除了大部分组织背景，在低MI时表现出主要的线性声响应(gydF4y2Ba\ \ (sim \)gydF4y2Ba32-34 dB组织消除)gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．获得的非线性集合由三个部分组成:未取消的组织(例如，血肿，由于其在高发射频率下的高回声)，循环微泡和噪声。使用SVD对这些组件进行分割。由于去相关率(如速度)的相对差异，上述信号分量将映射到不同的投影子空间。为了解释挫伤性脊髓损伤后出现的高回声血肿，前3个投影被排除，以去除未取消的组织，只保留循环微泡的信号。尽管这可能只在损伤后病例中是必要的，但基线数据和sci后数据都以相同的方式处理，以保持一致性。低速亚空间分辨投影，4-35，归因于组织灌注，而投影125-500归因于空间分辨的脉管系统，具有更高的流速gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．数字gydF4y2Ba4gydF4y2Ba说明了在更广泛的ULM处理管道的背景下的流量分割，并描述了ULM对组织灌注的代表性示例(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)和血管流动信号(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bae).从应用的角度看，如图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba说明ULM在描述脊髓不同区域方面的效用;图像显示颈椎5级，而不是图中所示的胸椎7/8级。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．颈椎和胸椎采集的数据以相同的方式处理。gydF4y2Ba

组织灌注饱和与较短的采集时间gydF4y2Ba

ULM通常需要较长的获取时间，限制了广泛的临床应用。这尤其适用于手持式术中具有自由移动目标(如脊髓)的应用，脊髓在硬膜囊内表现出一定的流动性，并受呼吸运动的影响。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在中度单侧挫伤伤后颈椎5级获得;灌注和血管流动图像均显示脊髓右侧缺血性缺损。为了评估微循环成像所需的数据量，量化了输出图像达到90%饱和时的总采集时间(即，在脊髓内90%的灌注像素处观察到信号(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bag).就数据要求而言，组织灌注饱和先于血管流动(9.0 vs 25.2 s)。我们假设这可能是由于低秩投影中相对较高的空间血管密度。考虑到使用线性阵列换能器的超声成像在固定的高程宽度上产生3D血管网络的2D投影，当投影到成像平面上时，微血管中大量最小的血管在空间上重叠。较大的血管在空间上更加离散。为了支持这一点，在灌注投影中检测到的轨迹总数比图中所示的病例的流量投影高5.6倍。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

ULM航迹数据的量化和显示gydF4y2Ba

除了生成超分辨率密度图和大幅降低图像饱和度的数据需求外，灌注ULM还实现了新颖的定量分析。描述单个微气泡通过目标区域的参数可以从轨迹数据中提取出来——例如，给定气泡在成像平面内的总停留时间，或者轨迹长度。密度图，本质上提供流经扫描平面的微泡浓度的绝对估计，在图中与参数图一起显示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(模拟)。对于这些参数化地图，平均平面内旅行距离(即轨道长度)显示在每个箱子中。在基线(图;gydF4y2Ba6gydF4y2BaA,b)，参数化图概括了灰质(中心“蝴蝶”)和白质(外围)之间有意义的生物学对比。挫伤后，气泡密度图像清楚地显示了同侧低灌注区(1.44 mm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)．相应的参数图显示，对侧灰质和邻近低灌注区半影组织之间的径道长度分级(41.5±3.01 vs. 33.0±2.31)gydF4y2Ba\ \ upmu \ ()gydF4y2Bam,分别;平均值±SD)。使用抗层粘连蛋白染色的金标准组织学方法。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(e,f)描述了微血管密度的差异(504 vs. 283血管/mm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)和平均血管长度(19.8±1.12 vs 16.5±1.51)gydF4y2Ba\ \ upmu \ ()gydF4y2BaM)对侧灰质和半本影之间的差异，从而支持在参数图中观察到的差异。gydF4y2Ba

在超声造影技术发展之前，诊断性超声缺乏一种适用于CT、MRI和PET等其他诊断性成像方法中微血管流量测量的造影剂。微泡造影剂的发展，以及专门的成像技术，已经克服了这一障碍，并为超声提供了一种在组织灌注水平上成像血液流动的手段，可以说，血液流动的组成部分具有最高的临床用途。作为氧和养分交换的部位，定量组织灌注具有重要的实验和临床意义。此外，它反映了器官对疾病、创伤和恶性肿瘤的适应性反应gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．然而，临床可用组织灌注定量技术的发展不足，导致其在更广泛的应用中受到限制。gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba与现有的多普勒方法相比，ULM在空间分辨率方面取得了非凡的进步，甚至与对比增强多普勒模式的最新创新相比也是如此gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．然而，现有的ULM方法由于使用线性脉冲方案来成像微泡而受到限制，这就妨碍了在组织灌注水平上研究最慢流动的微泡，因为它们的速度与组织背景重叠(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，与常规多普勒血流成像一样。这必然导致对局部微循环血流动力学的描述不完整。特别是，无法研究和量化毛细血管水平的流量是一个重要的限制，这在很大程度上将传统ULM数据的量化降至更大的血管解剖(例如，弯曲度，直径)和血流速度。这些参数与现有多普勒方法以较少依赖用户的方式(例如，没有外生对比，不容易受运动影响)更快速获得的参数没有本质区别。优秀的图像质量可能不足以抵消ULM在许多临床环境中的相对不实用性。虽然已经探索了一些减少获取和处理时间的有前景的选择，但诊断能力的实质性改进将补充这些方法，为临床采用提供更强的激励gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

在这里，我们开发了ULM的一个新的应用程序，它的实用性超出了提高图像分辨率。非线性平面波成像与基于特征的流动分割相结合，使ULM处理首次应用于微循环。除了提供组织灌注的高分辨率密度图外，定位和跟踪单个循环微泡造影剂引入了丰富的定量特征集。在脊髓损伤的背景下，在当前研究中探索的用例中，半影和对侧组织之间的平面内移动距离显示出明显的对比。简而言之，脊髓损伤是由原发性机械损伤导致缺血缺损，继发性进行性损伤扩大由水肿、肿胀和炎症驱动。在这种情况下，急性时间点半影组织的相对健康状况的识别和量化对于区分在继发损伤阶段可能有进一步损伤风险的组织是有价值的。非线性ULM结果强调定量微血管变化，描述低灌注半影组织，可通过急性手术(如减压、腰椎引流)或药物(如甲强的松龙)干预挽救gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．组织学分析证实了ULM数据，表明观察到的轨迹参数变化基于金标准方法观察到的微血管变化。特别是，平面内移动距离的减少可能是毛细血管碎片的描述，这是挫伤性脊髓损伤后的一种充分记录的病理生理现象gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

因此，非线性ULM填补了一个独特的诊断利基。常规多普勒和ULM成像均不能定量描述微循环流动。虽然超声造影丸动学对组织灌注变化敏感，但在单个平面上需要很长的采集时间(分钟)，这在临床上很难实现，限制了整体临床使用和接受。相比之下，非线性ULM对可变对比度流入具有鲁棒性，因为不需要捕获动态增强曲线;相反，只要气泡足够稀疏，可以进行定位和跟踪，就可以获取数据。虽然每个仓内轨道数量的增加将产生更接近真实平均值的估计值，但这些测量不直接依赖于采集时间或气泡浓度，即使轨道数量很少也可能有价值。考虑到与传统ULM相比，即使没有更先进的定位技术(例如，gydF4y2Ba\ \ (sim \)gydF4y2Ba10 s达到90%饱和度)，非线性ULM的数据采集在临床应用中可能更可行。此外，对于较大的血管，非线性ULM比传统ULM在血管可视化方面有适度的改进(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，可能是由于谐波信号的点扩散函数特性比基波信号小。从采集的角度来看，非线性ULM的一个潜在限制是需要额外的非线性脉冲序列发射脉冲;然而，当使用平面波传输时，这并不会实质性地影响有效成像帧率。gydF4y2Ba

目前的方法仍然受限于漫长的处理时间。运动校正是速率限制步骤(每秒采集数据的多分钟处理时间);这可以通过迁移到基于gpu的处理来缓解。通过实现更专业的微气泡定位算法，可以进一步缩短数据采集和ULM后处理的时间。而这里应用的加权平均方法在升级之前实现了相当快速的亚像素定位(gydF4y2Ba\ \ (sim \)gydF4y2Ba每秒5秒的处理时间)，基于神经网络的方法已被证明可以实现显著更快的速度，并且对密集的采集更具鲁棒性gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

非线性ULM在高衰减情况下(如深部腹部或经颅成像)可能会受到信噪比(SNR)的限制。在这些情况下，常规ULM可能对目标组织较深区域的血管更敏感，或对偏离成像平面的较小血管分支更敏感。然而，在硬膜外脊髓成像的背景下，一个现实的术中场景，给予常规脊髓减压和创伤性损伤后的稳定，非线性成分为ULM处理提供了足够的信噪比。gydF4y2Ba

为了对脊髓损伤后的脊髓成像，在这项研究中，前3个SVD投影被排除，以从低灌注区附近的高回声血肿中移除未取消的组织。值得注意的是，由于血肿的后向散射增加，这种限制可能特定于急性创伤应用，并且通常强烈依赖于线性信号消除的效果gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．未来的工作将探索最优秩阈值选择以及更复杂的流分割信号分解方法，以保留最大数量的低速流，并确保非线性ULM是鲁棒的，特别是在可变运动条件下。gydF4y2Ba

微泡成像的超声采集序列gydF4y2Ba

成像使用可编程研究超声系统(Vantage, Verasonics, Kirkland, WA, USA)结合15 MHz线性阵列换能器(Vermon, Tours, France)进行。采用自定义调幅5角平面波成像方案;支持这种方法的实现和理论以前已经详细描述过gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}．为清晰起见，此处转载详细信息。采集包括5个角度的平面波多普勒成像(−10到10度)，其中振幅调制序列在每个角度的基础上交错产生非线性多普勒采集(即取消组织背景)。接收端经过带通滤波(以15 MHz为中心)、调幅脉冲的缩放和求和以及延迟和波束形成后，各个角度发射的IQ数据进行相干复合，生成非线性图像帧。以400 Hz的有效脉冲重复频率重复这一过程，以生成720帧的最终非线性集成(1.8 s采集持续时间)。对于非线性ULM，多达22个总集合被采集用于处理(即，高达40秒的总采集时间)。非线性多普勒成像如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在Bruce et al中有详细描述。gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．机械指数为0.04，以避免循环造影剂的破坏。gydF4y2Ba

运动校正gydF4y2Ba

所有处理均使用Matlab (R2019b, Mathworks, Natick, MA, USA)进行。通过将SVD应用于信号的线性分量(即，增加半幅脉冲，而不是减去)来隔离组织特异性运动。gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．前15个最低速度预测被保留;这些与最高的时空相干性相关，因此排除了由于循环造影剂可能产生虚假位移估计的任何运动。选取第一个集合的中心作为全局参照系。在每次集成采集中，计算各帧与中心帧之间的二维相关系数。为了避免在给定框架和全局参考之间产生过大的位移(例如，峰值吸入vs静止)，需要累积位移估算值。每次相关系数改变一个设定的阈值(0.02)时，选择相对参考系。在每个相对参照系之间估计位移，并累积到全局参照系上游。对于任何给定的框架，然后估计感兴趣的框架和最近的相对参照系之间的位移，累积，并应用于将感兴趣的框架注册到全局参考。对于后续的每个集合，中心帧被选择为另一个相对参考系，并注册到全局参考，以便在每个集合采集内部和之间进行运动校正。 This is similar to techniques used in cardiac strain estimation^23gydF4y2Ba．位移场的估计和应用，以纠正原始的，非线性图像集合在一个非刚性的方式gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

流量分割和预处理gydF4y2Ba

在运动校正后，利用SVD将非线性集合采集分割为组织灌注和血管流动信号组件。简单地说，数据被重塑为2D casorati矩阵(即，每列一个线性化图像帧)，并使用Demené等人描述的SVD实现进行处理。gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．如Bruce等人所述，根据经验选择SVD投影包括灌注(第一个奇异向量，高时空相干性)和流信号(最后一个奇异向量，低时空相干性)的硬阈值。gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．简单地说，基于Power Doppler图像选择灌注子空间和流量子空间的秩阈值，然后应用于所有ULM处理。灌注子空间的等级逐渐增加，以减少散斑方差，同时最大限度地减少来自较大的、空间分解的血管组件的任何出血。流量投影的低端截止点被选择，这样更大的血管清晰可见，来自低速微循环流动的空间不相干信号被排除在外。灌注和流动集合在随后的步骤中分别处理，以生成独立的ULM图像。在流分割之后，从SVD中选择最后5个投影来描述噪声剖面。这是光滑的高斯滤波器(gydF4y2Ba\(\sigma = 20\)gydF4y2Ba)，并应用于svd滤波集合，以平衡整个图像深度的电子噪声gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．采用非局部均值去噪滤波，以减小伪气泡定位gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

微泡定位与跟踪gydF4y2Ba

不同的微泡定位方法被用于灌注和流动集成。对于灌注，对数据采用加权平均亚像素定位方法，不进行任何上标或额外滤波gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．这种方法不假设点扩展函数的形状。对于流动，采用了基于互相关的定位方法gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．在使用估计的高斯点扩散函数生成标准化的2D相关图之前，每张图像都被放大了3倍(最终像素尺寸为8x8 um)。对图像进行阈值处理(>相关系数为0.6)，识别局部极大值并记录为微泡中心。定位后，微气泡跟踪后续帧之间使用部分分配算法gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}．气泡使用最近邻方法进行配对，其中帧n中的气泡与帧n+1中最近的气泡配对。这是基于匈牙利分配算法，其中总配对距离最小化，但对噪声和伪定位更稳健。在流动情况下，为了降低最终图像中的噪声，将短于后续7帧的微气泡轨迹排除在外gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．灌注情况下保留所有轨迹。使用Savitsky-Golay滤波器(一阶，3帧窗口)平滑轨迹，线性插值10倍，所得到的位置信息在所有集成采集中累积，形成微气泡密度图。gydF4y2Ba

量化和参数化映射gydF4y2Ba

从每个轨迹中提取定量参数，以阐明微气泡通过成像样品体积的动力学。具体而言，量化了总长度、持续时间(例如，每个微泡在帧内的停留时间)和通过每个轨迹的平均速度。生成参数化图以可视化这些参数的空间分布。根据微泡密度图手动遮盖脊髓实质。随后，定义了均匀间隔的25 um方形箱。计算每个轨道的中心点，并用于将轨道分配到特定的箱子。对于每个参数，显示每个bin的分布平均值，覆盖在微泡密度图上。包含少于10个轨道的箱子被排除在外。gydF4y2Ba

鼠类脊髓损伤模型gydF4y2Ba

所有动物实验程序均经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准进行(规程#4362-01和#4512-01)，并符合美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室(ollaw)的reach指南和指南。雌性Long Evans大鼠(12-15周，200-250克，美国印第安纳波利斯Harlan实验室)使用异氟醚(5%诱导，2 - 3%维持，1 L/min O麻醉gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)．放置一根24g尾静脉导管并连接到一个三通阀上，给予微泡造影剂(0.1 mL Definity, Lantheus, Billerica, MA, USA)，随后进行生理盐水冲洗(0.2 mL, 0.9% NaCl)。颈椎节段2至胸椎节段2或胸椎节段5-11的覆盖区域被剃除、清洁并消毒。局部镇痛(利多卡因，1.5 mg/kg，布比卡因，1 mg/kg)在使用10号手术刀进行纵向切口前经皮下注射。在椎旁肌肉骨膜下剥离后，进行三节段椎板切除术，以暴露颈椎(C4-C6)或胸椎(T7-T9)脊髓进行硬膜外成像。在挫伤时，动物的C4和C6或T7和T9棘突稳定，在超声成像时，动物的C2和T2或T5和T11棘突稳定。使用Infinite Horizon冲击器(Precision Systems and Instrumentation, LLC, VA, USA)在C5或T8处造成150kdyn的挫伤。以C5为中心的轴向成像，或以胸椎中线为中心的纵向成像，在基线和急性损伤后(< 1 h)进行。在每个时间点，从大量注射造影剂后4分钟开始，获得15-22个非线性集合(总持续时间27-40秒)。gydF4y2Ba

组织学gydF4y2Ba

在急性图像采集和安乐死后，动物在经心灌注4%多聚甲醛(300 mL)前灌注冰冷的PBS (pH 7.4, 200 mL)。取椎板切除术中暴露的窗口对应的13毫米脊髓段，在4%多聚甲醛中4℃过夜固定。冷冻切片前，将组织置于含0.01%叠氮化钠的30%蔗糖溶液中冷冻保护。低温恒温器(CM1850，徕卡，Wetzlar，德国)用于获得20个gydF4y2Ba\ \ upmu \ ()gydF4y2Bam厚的组织切片，随后将其解冻安装在明胶镀膜的载玻片上，并在- 80°CC保存。组织切片进行层粘连蛋白染色(L9393, 1:500, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，使用已建立的免疫组织化学方案来观察脊髓组织内的脉管系统。荧光图像在ImageJ处理前使用Axio Zoom V16荧光显微镜(Zeiss, Oberkochen, Germany)获取。用自定义的Matlab脚本对组织学图像进行量化。在使用既定算法进行骨架化之前，使用Matlab内置函数(imbinalize)对图像进行阈值处理。gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba血管计数和解剖参数(直径、长度、弯曲度)来自骨骼数据。gydF4y2Ba