介绍

念珠藻属公社在干燥寒冷的贫瘠山区生长旺盛的低等杂生蓝绿藻是否能够形成由多糖组成的延伸果冻层1，2．念珠藻属公社含有丰富的蛋白质、多糖、氨基酸、脂质及多种维生素和金属元素，具有丰富的营养价值。许多报告已经证明，不同种类的念珠藻属含有多种独特的药用化合物(氨基酸、脂肪酸、多糖、抗菌物质)，具有良好的生物活性，如固氮3.降低患冠心病的风险4,抗氧化作用5, anti-microbico6，抑制人类t淋巴Jurkat细胞生长7,抗肿瘤8等。直到现在,n公社它还富含蛋白质、糖和脂质，以及微量元素和维生素9具有抗感染等有益生理功能10降低血脂水平11通过下调PI3K/AKT/mTOR通路激活自噬12抗菌和消炎13等。因此,n公社通常被称为“ishikurage”，以前在东南亚被用作食品成分或民间药物来预防和治疗疾病14．

已经指出，多糖n公社在抵抗极端干燥，容易恢复代谢活性和在补液时具有新的生物活性方面发挥重要作用，这些功能表现出构效关系15，16，17，18，19，20.．众所周知，提取方法对多糖的得率、结构特征和生物活性有显著影响21，22．传统的加热回流提取法是提取多糖最常用的方法。通常，该工艺的产率高度依赖于提取时间和温度15，23．然而，较高的提取温度和较长的提取时间可能导致多糖的降解和药理活性降低24．因此，为了提高多糖的提取率，采用了几种新的提取工艺25，如超声辅助提取(UAE)26，27，28微波辅助提取(MAE)。然而，对HRE法和UAE法所得多糖的物理性质、结构特征和生物活性进行比较的研究较少。采用超声辅助提取技术，从黄芪多糖中提取粗多糖念珠藻属公社在之前的研究中20.．本研究采用传统的加热回流提取、超声辅助提取和醇沉工艺对黄芪粗多糖进行了制备n公社对采自海拔2000 m左右的寒湿地区(中国甘肃省威源县)的黄芪进行了理化性质、结构特征和生物活性的研究，以评价其构效关系。

结果与讨论

用色谱法纯化HNCP3和UNCP4

DEAE-52色谱柱上分别加入10 mg/mL的HNCP3和UNCP4，用0-1.0 mol/L的NaCl溶液洗脱。以0.3 mol/L NaCl收集洗脱液，用苯酚硫酸法进行示踪，得到两个峰，回收率分别为29.34%和34.28%。样品经透析和冻干后，用Sephadex G 100色谱柱进一步纯化，得到两个单峰，分别为HNCP3和UNCP4。1A,B)，回收率分别为80.9%和86.4%，说明HNCP3和UNCP4可能为均质多糖29．因此，联合发酵是一种更有效的提取多糖的工艺n公社比一定是，并且由于空化、力学和热效应的综合作用，产生更多具有相似物理化学性质的分子30.．

图1
图1

DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100纤维素柱纯化HNCP3和UNCP4的洗脱谱和分子量分布。（一个): Sephadex G100纯化的HNCP3洗脱曲线;（B): Sephadex G100纯化的UNCP4洗脱曲线;（C):高效液相色谱-多角度激光散射法测定HNCP3的分子量分布;（D):用高效液相色谱-多角度激光散射法测定UNCP4的分子量分布。

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HNCP3和UNCP4的分子量

采用HPSEC-MALLS-RID技术测定HNCP3和UNCP4的平均分子量，结果见表1和无花果。1C, D。HNCP3和UNCP4样品的组成结构相似，但分子量分布不同，说明HNCP3和UNCP4均为异多糖。HNCP3和UNCP4的最高Mw分别为48.6 kDa和14.54 kDa，最低Mn分别为22.72 kDa和44.32 kDa。如表所示1UNCP4的平均分子量低于HNCP3，且UNCP4的低分子量分布(68.57%)大于HNCP3的低分子量分布(46.18%)，说明UAE法比传统HRE法能产生更多的低Mw馏分31．这可能是由于超声波对多糖进行了一定程度的降解，部分高分子量组分转化为低分子量组分，从而增加了低分子量组分的含量。在以前的报告中也观察到同样的现象29．

表1不同方法提取HNCP3和UNCP4的分子量分布。
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单糖组成分析

采用气相色谱-质谱法测定样品的单糖组成，结果如图所示。2．通过将HNCP3和UNCP4的保留时间与标准单糖的保留时间相匹配来分析它们(图2)。2A)，表明两种多糖具有不同的单糖组成。HNCP3由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔比为0.65:0.55:2.91:2.73;UNCP4由甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖组成，摩尔比为0.30:6.84:2.81。结果表明，HNCP3和UNCP4均在葡萄糖中富集，表明葡萄糖是主要的单糖。S. Jensen报道了从碱提取物中纯化的Nc-5-s单糖组成n公社为Glc、GlcA、Xyl、Man、Ara、Rib、Gal，比例为24:24:15:13:13:7:4。而单糖的水溶性多糖(NSKP)通过沉淀热水提取物从念珠藻属在40% (v/v)乙醇条件下，甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和葡萄糖醛酸的摩尔比为1.00:1.92:0.97:1.02:0.9132．结果表明，单糖组成的差异是由不同的加工方法和原料来源造成的33．

图2
图2

参比样品的GC-MS谱图。（一个) HNCP3;（B) UNCP4;（C) UNCP;（D) GC-MS分析HNCP甲基化的总离子色谱图;（E) GC-MS分析UNCP甲基化的总离子色谱图;（F) HNCP3甲基化产物的总离子色谱图;（G) UNCP4甲基化产物的总离子色谱图。

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HNCP3与UNCP4基因连锁分析

根据高酸盐氧化反应的结果，HNCP3和UNCP4的高酸钠消耗量分别为0.61 mol和0.93 mol，甲酸的总产生量分别为0.43 mol和0.65 mol。高盐酸消耗与甲酸生成的摩尔比分别为1.42和1.43，表明HNCP3和UNCP4可能含有1→2、1→2、6、1→3、1→3、6等糖苷键34．smith降解HNCP3的GC图如图所示。2D.甘油检测提示HNCP3可能含有1→、1→2,1→6和1→2,6糖苷键。赤藓糖醇的检测表明赤藓糖醇形成的键型存在，即1→4和1→4,6 -己糖。同时，对鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的检测表明，聚合物可能由4种单糖以1→3,1→2,3,1→3,4,1→3,6和1→2,3,4糖苷键连接。UNCP4 smith降解的GC图如图所示。2E，赤藓糖醇的形成表明可能存在1→4和1→4,6键己糖。甘露糖和葡萄糖的检测以及与未经高碘酸盐氧化的样品相比葡萄糖含量的增加表明，UNCP4大部分未被高碘酸盐氧化，聚合物主要与1→3或1→2,3或1→2,4或1→3,4或1→3,6或1→2,3,6或1→2,4,6糖苷键连接。甲基化分析通过GC/MS确定HNCP3和UNCP4中单糖间的连接(图2)。2F,G)，联动细节见表2．结果表明，HNCP3的甲基化产物为2,4,6 - me3 - glcp[峰1:→3)- glcp -(1→)]、2,3,6 - me3 - glcp[峰2:→4)- glcp -(1→)]、3,4,6 - me3 - galp[峰3:→2- galp -(1→)]、2,4,4 - me3 - galp[峰4:→2,6)- galp -(1→)]、2,3,4 - me3 - glcp[峰5:→6)- glcp -(1→)]、2,3,4 - me3 - galp[峰6:→6)- galp -(1→)]共6个相对摩尔比为1:1.34:1.28:1.98:3.32:3.12(表1)2)。由于该多糖的摩尔比较低，未检测到鼠李糖。推导出HNCP3的重复单元如下:

表2 HNCP3和UNCP4的GC-MS甲基化分析。
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图一个

UNCP4的甲基化产物由2,4 - me2 - rhap[峰1:→3)- rhap -(1→)]、2,3 - me3 - glcp[峰2:→4,6)- glcp -(1→)]、2,3,4 - me3 - glcp[峰3:→4)- glcp -(1→)]、3,6 - man - glcp[峰5:→3)- glcp -(1→)]、2,4 - me2 - glcp[峰6:→3,6)- glcp -(1→)]、2,4 - me2 - glcp[峰6:→3,6)- glcp[峰6:→3,6)- glcp -(1→)]、2,4 - me2 - glcp[峰6:→3,6)- glcp[峰6:→3,6)- glcp -(1→)组成，相对摩尔比为1:24 .63:36.13:41.32:9.87:17.782)。结果显示，在UNCP4中存在以下重复单位。

图b

目前，已有多种植物多糖被报道具有抗氧化活性，包括绿藻、褐藻和红藻等藻类多糖35，36，37．据报道，大多数具有突出生物活性的多糖是由(1→3)糖苷键连接的，该糖苷键具有β -(1→3)- d -葡聚糖主链和一些侧链38，39．然而，植物多糖的结构和立体构型非常复杂，其结构-功能关系有待进一步研究。可食用的蘑菇(Calocybe籼)具有免疫刺激活性，其一级结构骨干与HNCP3和UNCP4具有相同的α-D-Glcp-(1→4)糖苷单元40．Toona sinensis叶多糖对小鼠急性肝损伤具有良好的抗氧化及其他保护作用41．其中,Toona sinensis叶多糖TSP-1主链与HNCP3具有相同的α-D-Manp-(1→6)糖苷单元，与UNCP4具有相同的α-D-Glcp-(1→6)糖苷单元。支链与HNCP3具有相同的α-D-Glcp-(1→)糖苷单元，与UNCP4具有相同的α-D-Manp-(1→3)糖苷单元。的初级结构的检测念珠藻属公社多糖证明其多糖主链含有α-D-Glcp-(1→4)、α-D-Manp-(1→6)或α-D-Glcp-(1→6)糖苷，而侧链含有α-D-Glcp-(1→)或α-D-Manp-(1→3)糖苷，推测其具有潜在的抗氧化活性。总之，这些甲基化结果与HNCP3和UNCP4的高盐氧化和smith降解的观察结果一致。

FT-IR光谱和TGA/DSC检测

HNCP3和UNCP4的光谱没有明显的差异，如图所示。3.A,B，说明不同方法提取的HNCP3和UNCP4具有相似的官能团。在3400 cm处，吸收非常明显−11100厘米−1，这是由O-H连杆的拉伸和角振动引起的42．在3423.085 cm处的吸收−1归因于C-H伸缩振动。在1637 cm处有一个不对称的拉伸峰−1吸收峰大约在1412cm处−1是否羰基和羧基存在的指标拉伸振动43，44．两个吸收峰位于1064.531 cm处−11062.603厘米−1与吡喃糖环的C-O-C或C-O-H的拉伸振动相对应，证实了HNCP3和UNCP4含有吡喃糖45．中峰在590厘米处−1弱峰在586 cm处−1分别与α和β-糖苷键的存在有关。

图3
图3

HNCP3 (一个)及联合国预防罪案委员会(B)。(NCP念珠藻属公社多糖)。DSC检测HNCP3 (C)及联合国预防罪案委员会(D)。

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用热重(TG)谱法测定了hncp3和UNCP4在25 ~ 300℃加热过程中的失重情况。如图所示。3.C,D，结果显示在25-248°C左右，水的损失相当于一个阶段的重量损失。曲线显示，UNCP4在248°C之前没有分解，在71.97°C时失重相对平稳，达到10.97%，而HNCP4在216°C时开始分解，在90.09°C时失重速度更快，达到13.35%。据报道46水是由聚合物羟基分子内和分子间缩合形成的，聚合物的分解发生在300℃以下。UNCP4的失重率低于HNCP3，说明UNCP4可能具有较好的热稳定性，也可能具有凹凸不平的织构和粗糙的疏松表面47．

采用差示扫描量热法(DSC)测定HNCP3和UNCP4随温度升高的放热或吸热变化(图2)。3.C, D)。其中，参与能量变化的三个关键温度点记为T0(初始温度)，Tp(中间温度)，和Tc(最终温度)。两种多糖均表现出无定形部分。HNCP3、UNCP4的玻璃化转变温度分别为61.2℃和62.8℃，无熔融峰。在HNCP3和UNCP4中观察到连续(广泛)吸热转变，表明水分损失。数字3.C显示HNCP3的焓变值为- 211.6 J/g，放热峰相对平缓，温度超过249.9℃，热解反应进行相对平稳。然而，HNCP3的焓变值为- 226.1 J/g，在248.4℃以上出现了一个陡峭的放热峰，热解反应进行得更为剧烈(图2)。3.D).总之，通过DSC曲线分析，两种多糖的差异不大。

HNCP3和UNCP4的SEM和AFM观察

不同的提取方法会影响多糖的微观结构48，49通过SEM和AFM对HNCP3和UNCP4的形貌和结构进行了观察(图2)。4)。在100 μm分辨率下，HNCP3表面光滑，呈不规则锯齿状，呈丝状片状连接(图2)。4A)， UNCP4表面光滑均匀，具有明显的蜂窝状和螺旋状空隙结构(图2)。4B)，这表明两种多糖之间的变化可能是由于加热时间长，温度高，超声波振动引起的空化效应。这些结果与先前报道的结果相似，UAE对多糖的微观结构有更大的影响50．

图4
图4

的扫描电子显微照片念珠藻属公社: JSM-7001E显微镜在100 pm比尺处获得的HNCP3和UNCP4的SEM图像(一个)及晚上十时(B）;（C，D)利用Multimode 8仪器(Bruker, USA)在攻丝模式下获得HNCP3和UNCP4的原子力显微图。

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为了进一步观察HNCP3和UNCP4的精细结构，采用原子力显微镜进行形态学观察。如图所示。4C、D、HNCP3和UNCP4分子呈椭球状。UNCP4分子排列松散，大小形状均匀，分子水平长度为226.56 nm，垂直高度为7.126 nm。与UNCP4相比，HNCP3分子的大小和形状不同，具有大量的球形胶束和少量的分散，分子的水平长度为101.56 nm，垂直高度为13.961 nm。根据以上结果，我们可以推测UNCP4中存在分子聚集，其结构单元可能存在分支和相互缠绕。SEM和AFM分析为UAE提高多糖提取效率提供了有力的证据。

HNCP3和UNCP4的抗氧化活性

各种抗氧化机制已被报道，包括抑制链起始，螯合金属离子，过氧化物分解和自由基清除51，52．然而，HNCP3和UNCP4抗氧化活性的作用机制尚不清楚。HNCP3和UNCP4的抗氧化活性在图中进行了估计和展示。5，即自由基清除率随着样品浓度的增加而逐渐增加。数字5与Vc相比，A显示HNCP3和UNCP4对DPPH·自由基的清除能力。在所有样品中，阳性对照Vc溶液清除率最高，在浓度为0.2 mg/mL时达到95.41%的最大值。当浓度为1.0 mg/mL时，UNCP4的清除率为52.72%，高于HNCP3的40.21%。HNCP3和UNCP4去除超氧阴离子自由基的结果如图所示。5B.随着浓度从0.2 ~ 1.0 mg/mL的升高，清除率显著提高，1.0 mg/mL时对HNCP3和UNCP4的最大清除率分别为30.12%和26.02%。数字5C表现出HNCP3和UNCP4对清除剂·OH的作用，其最高清除率分别为22.71%和26.70%，明显低于Vc对羟基自由基的清除作用。以往的研究报道了粗多糖(HRSA)的清除作用n公社当浓度为10 mg/mL时，对HO·的吸附率可达92.71%53．HNCP3和UNCP4抗氧化作用的机制可能是通过向自由基提供氢原子，从而终止自由基链式反应，将自由基转化为无害产物15，54．在本研究中，HNCP3和UNCP4表现出不同的抗氧化活性，这与它们的单糖组成比例和侧链连接有关。此外，超声波对高分子量多糖有一定的降解作用，使其抗氧化活性发生变化55．

图5
图5

HNCP3、UNCP4和维生素C (Vc)的抗氧化活性。注意:(一个)不同浓度样品对DPPH自由基清除能力的影响;（B)不同浓度样品对羟基自由基去除的影响;（C)不同样品浓度对超氧阴离子去除率的影响。

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据报道，多糖的分子量、溶解度、粘度等物理性质以及提取方法都会影响植物多糖的抗氧化作用56．Yang等人发现热水提取和超声辅助提取侧耳属citrinopileatus多糖具有较强的自由基清除能力57．此外，Ni等研究了八种植物多糖的单糖组成及其清除DPPH的活性。结果表明，8种多糖的DPPH自由基清除能力与多糖含量无关，而与微观结构有关，单糖组成对多糖抗氧化活性影响的具体方式和强度有待进一步研究58．在本研究中，两种提取方法提取的多糖浓度为1 mg/mL时，UNCP4的抗氧化作用略强于HNCP3，但不显著。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率

HNCP3和UNCP4通过减少糖苷键的断裂和释放葡萄糖，抑制参与糖代谢的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性。如图所示。6A，当样品浓度为3.0 mg/ml时，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，为86.42±1.59%，对HNCP3和UNCP4的抑制率最高，分别为60.03±1.58%和79.01±1.41%。同时，HNCP3和UNCP4对α-葡萄糖苷酶的抑制活性如图所示。6B，其中抑制比呈剂量依赖关系。HNCP3和UNCP4对α-淀粉酶的抑制率最高，分别为57.76±1.88%和77.72±2.03%。结果表明，HNCP3和UNCP4能够抑制食物中碳水化合物的代谢，有效降低机体餐后血糖水平59．

图6
图6

HNCP3和UNCP4对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率。

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事实上，已经发现许多植物和水果提取物对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，而且副作用很小60．虽然HNCP3和UNCP4的抑制作用低于阿卡波糖，但结果表明它们可能是α-葡萄糖苷酶的潜在抑制剂。在本研究中，HNCP3和UNCP4抑制活性的差异可能是由于超声辅助提取在中温条件下可以在短时间内提取和/或保存更多具有抗高血糖活性的生物活性化合物61．

念珠藻属公社含有丰富的蛋白质、钙、磷、铁等营养成分，长期作为配料供人体食用，具有降脂、清热、明目等功效。多糖是具有生物活性的重要活性成分念珠藻属公社，目前尚不清楚。近年来，随着抗氧化剂的蓬勃发展，已逐步从单纯的人工合成抗氧化剂发展到从天然产物中获得的天然、绿色、高效、低毒的体内自由基清除剂。糖尿病是威胁人类健康的三大持续性疾病之一，其死亡率仅次于心血管疾病和癌症。糖尿病治疗药物的开发一直是研究的热点。许多种类的多糖已被发现在天然产物成分中具有一定的抗糖尿病活性。因此，在本研究中，念珠藻属公社对热水浸提和超声辅助提取的多糖进行了纯化和结构表征。并对其抗氧化和抗糖尿病活性进行了探索性研究。结果表明，HNCP3和UNCP4具有一定的清除自由基活性。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是食物中碳水化合物消化的重要酶。α-淀粉酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，减缓葡萄糖的转化和吸收，降低餐后血糖峰值，调节血糖水平，从而减少血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素的敏感性，保护胰腺功能，有效预防和改善糖尿病的发生和发展。本研究检测了两种方法提取的多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性，发现HNCP3和UNCP4均具有一定的抗糖尿病作用。

结论

本研究中，HNCP3的平均分子量大于UNCP4的平均分子量。红外光谱显示了UNCP4和HNCP3的构象特征，即两种多糖具有相似的特征吸收峰(O-H伸缩振动、C-H伸缩振动、C-H变角振动和C-O键)和不同的透射峰。AFM和SEM图像显示分子聚集和多糖构象。HNCP3疏松，呈柔软的纤维质地，UNCP4干燥，表面有少量分枝。单糖组成分析表明，HNCP3和UNCP4的单糖组成仅在摩尔比上存在差异。两种多糖的抗氧化活性比较表明，UNCP4具有较强的抗氧化和降糖活性。综上所述，超声辅助提取对NCP的结构和溶液构象有一定的影响，特别是对溶液性质和链构象的影响会影响多糖的生物活性。因此，系统研究超声对中药多糖高级结构的影响具有重要意义。

材料与方法

材料

念珠藻属公社一种植物属于属吗Nostocaceae，蓝藻，Nostocaceae．形态上，初呈胶状球形，后扩张成片状，可达10厘米，似胶状皮层，深橄榄或茶褐色，干燥后为深褐色或黑色。藻丝卷曲，仅在群的周缘有明显的胶状鞘，黄褐色，厚而层状，在横隔处收缩。风干的子实体n公社由甘肃康鑫源生态农业科技开发有限公司(兰州)提供。生产原料参照食品安全企业标准Q/SXZN0001S-2019磨软。植物(栽培或野生)，包括收集的植物材料，符合相关机构、国家和国际准则和法规)，经高速粉粉机(FZ102，北京中兴伟业仪器有限公司，北京，中国)粉碎成0.178 mm的细粉，室温保存至使用。单糖标准品(鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、焦糖、葡萄糖醛酸)α-淀粉酶购自中国北京Solarbio科技有限公司，1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，阿卡波糖溶液、对硝基氨基葡萄糖苷(PNPG)和α-葡萄糖苷酶购自美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为分析级试剂。

加热回流萃取

HRE在先前报道的方法基础上进行了一些修改62．粉末n公社(5 g)用去离子水(250 mL)在平底烧瓶中85℃回流提取190 min，提取液经Savage法(氯仿:丁醇按4:1的比例)处理三次以去除蛋白质。脱蛋白液加入无水乙醇，最终浓度为80% (V/V)，在4℃下沉淀12 h，用真空冷冻干燥机(SCIENIZ-18 N, Ningbo Biotechnology Co.， Ltd, Ningbo, China)对沉淀进行冻干，得到粗多糖n公社(HNCP)。

超声波协助提取

对粗多糖(UNCP)进行了详细的UAE工艺63．在料液比为1:50，溶剂为无水乙醇，提取温度为353.15 K，超声功率为540 W，提取时间为25 min的最佳提取条件下提取UNCP，然后按照“单糖组成分析”一节。

粗多糖的纯化及平均分子量的测定

将HNCP和UNCP分别取200 mg配制成10 mg/mL的溶液，分别上样于DEAE-52阴离子交换色谱柱(2.6 × 45 cm)上，以0 ~ 1.0 mol/L的梯度NaCl梯度洗脱，流速为1 mL/min。用0.3 mol/L NaCl溶液收集HNCP3和UNCP4馏分，透析(MWCO: 8-14 kDa)，冻干，得率为24.5 mg。冻干后的样品用去离子水以1 mL/min的流速对Sephadex G100进行进一步纯化，进一步研究。HNCP3和UNCP4的分子量由高效液相色谱和多角度激光散射测定。

高碘酸盐氧化多糖理化性质的改性

如前所述，HNCP3和UNCP4的单糖组成通过气相色谱(GC)获得。63，具体步骤按报道的方法进行，并做了一些修改。将30 mg HNCP3和UNCP4与30 mL高碘酸钠溶液(15 mmol/L)混合，在4°C的暗室中用磁力搅拌器充分溶解。取1.0 mL混合溶液移至安瓿中，放入250 mL容量瓶中，用去离子水稀释至体积。用紫外分光光度计每隔6 h测量溶液在223 nm处的吸光度，直至吸光度值保持不变。用高碘酸钠标度法计算高碘酸盐的消耗量。取2.0 mL反应溶液加入0.5 mL乙二醇终止反应，用NaOH标准溶液(0.01 mol/L)滴定，指示剂为酚酞。记录滴定液的体积，并按下式计算甲酸的量1．

$ ${\文本{y}} = (x \ * {n \ mathord{\左/ {\ vphantom {n 2}} \。\kern-0pt} 2}) \乘以v$$
（1）

注y为甲酸产量，x为NaOH的精确浓度，n为滴定体积，v为反应体积。

气相色谱条件为:ThermoITQ1100气相色谱仪;FID检测器;HP-5柔性石英毛细管柱(0.32 mm × 0.25 μm × 30 m);N2作为载气;流速为1ml /min;1:10为分割比;220℃为进口温度;250℃为探测器温度;程序升温(160°C作为启动温度，并在10°C/min下升温至240°C)。

HPLC色谱条件为:色谱柱为TSK-GELG6000PWXL;流动相为0.2%迭代钠水溶液，流速为1 mL/min，柱温为30℃，检测器为差示折射率检测器，进样量为20 μL。

HNCP3和UNCP4的Smith降解和甲基化分析

将上述以乙二醇终止的周期性酸氧化反应溶液转移到透析袋(3500 Da)中，用蒸馏水透析48 h，加入100 mg硼氢化钠，在黑暗中混合24 h，再用50%醋酸中和，使多余的硼氢化钠分解。将中和后的溶液透析48 h，冷冻干燥。将干燥后的样品(10 mg)用2 mL三氟乙酸(2 mol/L)在120℃下水解3 h，用甲醇反复蒸发去除多余的三氟乙酸。残渣用0.5 mL吡啶和10 mg盐酸羟胺在95℃下混合处理30 min，再用0.5 mL乙酸酐在95℃下乙酰化35 min，用氮气吹干，用1ml氯仿溶解，用蒸馏水洗涤2次。采用氯仿层溶液1ml，在所建立的分析条件下进行气相色谱测定64．分别取单糖标准品、甘油、赤藓糖醇5 mg，按上述方法进行气相色谱分析。

对HNCP3和UNCP4进行甲基化，分析多糖的连锁模式

将HNCP3和UNCP4分别溶解于1.5 mL DMSO (1.5 mL)中，然后加入1.5 mL NaOH (50%)-DMSO溶液(V:V = 1:1)，在30℃下反应3 h。加入0.5 mL甲基碘，在30℃下暗处N下搅拌2.5 h2用1ml去离子水终止反应。上述操作步骤重复三次，直到OH基团的吸收峰基本消失。甲基化的HNCP3和UNCP4用H进一步水解2所以4(2 mol/L)，在120℃下放置2 h，在氮气保护下旋转蒸发干燥。将旋转干燥后的样品用NaOH溶液溶解，加入25 mg硼氢化钠，在25℃下振荡2 h，用乙酸调节pH至5.5-7.0，去除多余的硼氢化钠。

随后，将还原后的样品与0.7 mL吡啶和1 mL乙酸酐在90℃下混合30 min，使反应产物乙酰化。将干燥后的反应产物溶解于乙酸乙酯中，用GLC-MS系统(THERMO 1310 GC-ISQ LT MS，美国)分析，并配备TG-200MS毛细管柱(30 mm × 0.25 mm, 0.25µm)。具体程序为:从160℃至210℃，以2℃/min的速度升温，再以5℃/min的速度升温至240℃，最后保持20 min。MS扫描范围设为m/z 35-4000。

FT-IR光谱分析和TGA/DSC测量

采用FT-IR分光光度计(Nicolet iS5, Thermo Fisher Scientific, USA)在4000-400 cm扫描范围内测定HNCP3和UNCP4的有机官能团−1分辨率为4厘米−165．在Al中放置HNCP3和UNCP42O3.在TGA/DSC同步热分析仪(STA449C, Netzsch, Germany)上以氮气作为保护气体，以10°C /min的速率将温度提高到350°C。66．变性温度采用Origin 9.0数据分析软件计算。

HNCP3和UNCP4的分子表面形貌观察

为了研究不同提取方法对多糖微观结构的影响，将HNCP3和UNCP4固定在包金硅片上，通过扫描电镜(SEM, JSM-5600LV, American Kevex Company, America)进行观察。同时，取50µL HNCP3和UNCP4(1.0µg/mL)滴于云母底物上，室温干燥过夜。然后用AFM (MultiMode-HR, Brooke, USA)研究了HNCP3和UNCP4大分子的构象转变。67．

体外抗氧化活性测定

根据我们之前描述的方法65，68，69制备不同浓度(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL)的HNCP3、UNCP4和Vc溶液，从清除DPPH自由基能力、清除超氧阴离子能力和清除羟基自由基能力等方面评价其抗氧化活性。分别在试管中加入浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的HNCP3和UNCP4粗多糖1 mL。然后加入5mmol /L DPPH溶液5ml，摇匀后置于暗处30min。以5ml无水乙醇与3ml蒸馏水的混合物为参比，测定517 nm处吸光度值。通过公式计算DPPH清除活性2．

$ ${\文本{清除活动}}\左(\ % \右 ) \, = \, [ 现代{0}(现代{我}-现代{j})] /现代{0}\ * \ 100 \ % $ $
(2)

请注意一个0为空白对照液用蒸馏水代替样品溶液的吸光度;一个我为样品溶液的吸光度;一个j为用蒸馏水代替显色剂对样品溶液的吸光度。

分别向试管中加入浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的HNCP3和UNCP4粗多糖1 mL和pH为8.2的Tris-HCl缓冲液3 mL。在25℃水浴中反应20 min，加入0.3 mL 7 mmol/L邻苯三酚，反应4 min后，加入1 mL 10 mol/L HCl，在420 nm处测定吸光度。用公式计算了其清除超氧阴离子的能力2．

2 mL的HNCP3和UNCP4粗多糖，浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1 mL的9 mmol/L FeSO4在试管中加入9mmol /L水杨酸-乙醇溶液2ml。然后2ml 8.8 mmol/L H2O2在室温下反应1 h，用蒸馏水调零，在510 nm处测定样品的吸光度值。用公式计算其对羟基自由基的清除能力2．

体外抗糖尿病活性

通过对代谢碳水化合物的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，评价HNCP3、UNCP4的体外降糖能力67．样品浓度(IC)50)，也计算了抑制酶50%的能力。具体来说，HNCP3和UNCP4分别溶解在磷酸盐缓冲液(0.2 mo1/L, pH 6.6)中，浓度分别为1mg /mL、2mg /mL、3mg /mL、4mg /mL、5mg /mL、6mg /mL。在不同浓度的样品溶液中加入0.2 mL α-淀粉酶溶液(6 U/mL)，再加入0.4 mL淀粉溶液(1%)，在37℃下反应10 min。依次加入2 mL DNS试剂，在沸水中反应10 min，在520 nm处测定吸光度70．根据公式计算α-淀粉酶的抑制率3.．

$ $ \α{{\文本-淀粉酶抑制率 (\% )}} = \ 压裂{{现代{0}(现代{1}-现代{2})}}{{现代{0}}}\乘以100 $ $
(3)

请注意一个0为空白对照吸光度，一个1是多糖样品的吸光度，和一个2为基管的吸光度。

96孔板405 nm处对硝基苯酚释放量测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。不同浓度样品20 μl， α-葡萄糖苷酶10 μl (2 U/ml)，磷酸盐缓冲液50 μl (pH 6.8, 100 mM)， 37℃孵育15 min，然后加入20 μl (5 mM)对硝基苯酚葡萄糖苷(PNPG)，同样温度孵育20 min，加入150 μl碳酸钠(0.1 M)停止反应，以阿卡波糖为标准品。根据公式计算抑菌率4．

$ $ \α{{\文本-葡糖苷酶抑制率 }}(\% ) = \ 左({1 - \压裂{{现代{1}-现代{2}}}{{现代{3}-现代{0}}}}\)\乘以100 $ $
(4)

一个0为空白吸光度，一个1为多糖样品的吸光度，一个2是样品的空白吸光度，和一个3.是对照物的吸光度。

统计分析

数据以mean±SD表示，并采用GraphPadPrism5进行方差分析(ANOVA)和T检验(及非参数检验)的统计学显著性检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。