GTS-21,选择性alpha7烟碱乙酰胆碱受体激动剂,改善糖尿病肾病LeprgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}老鼠gydF4y2Ba

在美国有超过3400万人患有糖尿病,和这种疾病的发病率上升全球(国家糖尿病统计报告,美国疾病控制与预防中心)。超过90%的病人患有2型糖尿病(T2DM)病人体内代谢紊乱,导致高血糖症伴有多种严重的并发症包括:失明,心血管疾病和肾功能衰竭gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。在这方面,糖尿病肾病(DN)的主要原因是终末期肾病(ESRD)导致死亡的风险增加gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。虽然在T2D肾脏疾病的发病机制是多方面的,很明显,高血糖,高血脂,氧化应激,血流动力学障碍,炎症和凋亡细胞死亡都是主要因素gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}。合成肾脏损害特点是蛋白尿,足突细胞的损失,和组织学变化,包括矩阵系膜扩张,增加肾小球的大小gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。血液测试表明,增加肾损伤的循环水平molecule-1 (KIM-1)和中性粒细胞gelatinase-associated lipocalin (NGAL)肾脏损伤的生物标志物DN,,他们的水平与蛋白尿的严重性增加DNgydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。了解DN的成因和治疗高血糖的可用性,很容易造成肥胖,db / db的老鼠有一个自发的点突变的瘦素受体(Lepr)导致受体信号的损失。这些老鼠db / db响应α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)受体激动剂GTS-21施加的血液降糖效果gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba,因此GTS-21可能是之前未治疗DN,在目前的研究探索。gydF4y2Ba

db / db鼠标应变发展脂肪量增加了4周的年龄,和弗兰克高血糖与蛋白尿八周的年龄。肾损伤的组织学证据包括肾小球肥大和系膜扩张矩阵从8到16周的年龄。增加IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白在肾脏也可检测从db / db小鼠四个月。然而,肾小球基底膜(GBM)是未见增厚,直到12个月的年龄,和db / db老鼠不开发mesangiolysis,结节性间质硬化或进行性肾功能不全,在人类一样DNgydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。尽管有这些限制,db / db老鼠代表一个好的模型进行分析的早期病理改变,发生在人类的DN。gydF4y2Ba

目前的研究认为的可能性与DN db / db老鼠,GTS-21施加有益的影响通过模仿迷走神经胆碱能抗炎反射通路(帽)。在解剖学上,外围传入迷走神经参与帽腹腔内炎症信号和脑干传达这一信息gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。合成反射的传出迷走神经活动减弱系统性炎症通过刺激α7nAChR位于细胞的免疫系统gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。重要的是,限制途径调节炎症和血糖控制糖尿病小鼠模型,以及小鼠模型实验急性肾损伤(AKI)gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。因此,有益CAP-mediated抗炎效应可能被系统管理复制GTS-21α7nAChR表演。记住这一假设,我们检查了GTS-21肾功能和伤害的行为在db / db的DN模式。这里介绍新发现提供证据表明,帽和α7nAChR相关治疗目标改进的DN T2D的上下文中。gydF4y2Ba

行动GTS-21肾功能,损伤和炎症gydF4y2Ba

包子和血液中肌酐水平是常见的肾脏功能的指标。KIM-1和NGAL在血浆和肾组织是急性/慢性肾损伤的生物标志物。在这些实验中,我们审查的能力GTS-21肾功能减弱的影响2型糖尿病,损伤和炎症。db / db老鼠证明显著增加等离子体包(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和肌酸酐(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)与db / +小鼠(P < 0.05与db / +老鼠)。相比之下,db / db小鼠接受GTS-21展示显著减少等离子体包和肌酐与db / db控制(P < 0.05与db / db)。db / db老鼠也展示高水平的血浆和肾损伤生物标志物KIM-1(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC, E)和NGAL(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD, F)相比,db / +车辆控制。GTS-21显著减毒的增加血浆和肾KIM-1 NGAL db / db中观察到小鼠(p < 0.05,与db / db车辆)。gydF4y2Ba

il - 6和HMGB-1炎性细胞因子。肾和血浆炎症标记物水平的测量来评估的影响GTS-21在db / db小鼠炎症。如无花果所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Badb / db老鼠证明增加血浆和肾il - 6和HMGB-1水平与db / +老鼠。治疗GTS-21显著减毒的海拔il - 6和HMGB-1 db / db的小鼠(P < 0.05,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。总的来说,这些结果提供的证据表明,在改善肾功能α7nAChR激活中起着重要作用,调节肾损伤和调节肾脏炎症在db / db老鼠。gydF4y2Ba

糖尿病肾病的组织学评估gydF4y2Ba

系膜扩张矩阵的特征是增加细胞外基质(ECM)组成的IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等在DN的db / db小鼠模型。由于ECM的增加,肾小球系膜阻力指标空间也许可以矩阵和扩展。当肾小球膜膨胀,它限制和扭曲了肾小球毛细血管,导致降低毛细过滤在db / db的DN模式。系膜基质膨胀了PAS染色的不同群体如无花果所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba得了。中描述的肾小球系膜基质区域量化方法和图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Bad .描述gydF4y2Ba^13gydF4y2Badb / db老鼠证明相比,系膜基质面积显著增加使用db / +杂合的控制(P < 0.05与db / +车辆)。治疗db / db小鼠GTS-21显著降低肾小球系膜增殖区(P < 0.05与db / db)。这些数据提供了证据表明GTS-21可以减弱DN的组织学变化,观察到在db / db小鼠模型。gydF4y2Ba

GTS-21变弱的线粒体功能障碍和肾细胞凋亡gydF4y2Ba

细胞凋亡或程序性细胞死亡中特异表达许多疾病,包括糖尿病,导致器官功能障碍。在DN,受损的线粒体细胞色素C的释放引发肾细胞凋亡。肾脏的细胞色素C蛋白水平测定通过免疫印迹,如无花果所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa细胞色素C含量的增加中观察到肾脏从db / db老鼠被GTS-21明显减弱。我们检查了肾细胞凋亡通过测量的相对丰度pro-apoptotic蛋白质裂解caspase-3(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)和伯灵顿(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)。TUNEL染色(图是用来确定凋亡细胞。gydF4y2Ba4gydF4y2BaD)。肾功能水平的伯灵顿(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)和裂解caspase-3(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)在肾脏从db / db显著增加小鼠和被GTS-21减毒。符合这一观察,TUNEL-positive肾脏细胞的相对丰度从db / db老鼠减少治疗GTS-21(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaD, E)。这些发现提供证据表明GTS-21可以减弱线粒体损伤和细胞凋亡在肾脏从db / db老鼠。gydF4y2Ba

PI3K / AKT激活和p38 MAPK通路在db / db老鼠gydF4y2Ba

PI3K / AKT通路是一种胞内信号通路,调节新陈代谢,增殖,细胞生存和增长反应细胞外信号gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。p38增殖蛋白激酶(p38 MAPK)通路被激活的细胞外压力和调节许多细胞反应包括细胞分化、细胞凋亡和自噬gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。探讨PI3K / AKT的角色和p38 MAPK信号通路在db / db的DN模式磷酸化信号总蛋白质的比例在肾脏的免疫印迹分析作为一个衡量指标信号通路激活。如无花果所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA和B的比例磷酸化/ PI3K和AKT总量明显减少从db / db小鼠肾脏(db / db车辆和db / +车辆,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)和减毒治疗GTS-21 (db / db GTS-21与db / db车辆,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。相比之下,磷酸化的比例/总p38(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC)增加肾脏从db / db老鼠(db / db车辆和db / +车辆,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)和改善GTS-21 (db / db GTS-21与db / db车辆,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。这些结果提供证据PI3K / AKT信号通路中表达下调和p38 MAPK通路调节肾脏从db / db老鼠。治疗GTS-21似乎减弱PI3K / AKT的变化和p38 MAPK信号从db / db小鼠肾脏。gydF4y2Ba

DN的发病机制是多方面的,包括血流动力学、代谢和其他因素。临床上,diabetes-induced激活肾素-血管紧张素轴的抗高血压的药物治疗。高血糖和高脂血症治疗血糖控制和降脂治疗。尽管有这些干预措施,控制炎症,活性氧(ROS),免疫细胞激活、代谢等因素持续存在可能导致进行性肾损伤患者2型糖尿病gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。当前的研究考察的能力α7nAChR兴奋剂,GTS-21,减弱肾损伤在db / db小鼠模型。gydF4y2Ba

α7nAChR调和许多抗炎作用的帽子。田中等人的研究表明vagal-mediated神经免疫电路提供保护从小鼠的肾损伤gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。符合这一发现,Chatterjee等人演示α7nAChR在老鼠和人类的存在肾细胞,以及GTS-21的能力减弱脂多糖(LPS)全身的肾脏炎症和损伤gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}。GTS-21也已被证明能够减弱cisplatin-induced急性肾损伤gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。最近两次评审提供证据的一个重要的角色在衰减inflammation-induced肾损伤gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

我们相信这是第一个研究的影响限制和α7nAChR兴奋剂GTS-21 DN。我们的主要结论包括:GTS-21改善肾功能(面包、铬),调节炎症(il - 6, HMGB1),减少肾损伤(KIM-1 NGAL),减少DN的组织学证据(系膜扩张矩阵)和变弱的线粒体损伤/凋亡(细胞色素C,伯灵顿,裂解caspase-3)在db / db老鼠DN。这些发现与变化PI3k / AKT激活和p38 MAPK信号通路在肾脏从db / db老鼠,和GTS-21减毒的。集体他们提供证据α7nAChR受体激动剂可能是有用的在预防DN。gydF4y2Ba

进一步的研究将需要完全阐明机制GTS-21变弱DN。然而,从我们实验室以前的工作和其他人提供洞察一些潜在的机制。王等人表明GTS-21刺激glp - 1在体外培养L细胞分泌,提高循环glp - 1在老鼠体内当管理水平gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。最近孟等人的研究显示GTS-21改善血糖控制在db / db老鼠和血糖的影响需要α7nAChR和GLP-1R刺激gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。这些结果提供的证据表明,GTS-21-mediated改善血糖控制很可能有助于改善DN的db / db模式。gydF4y2Ba

高血糖导致活性氧的发展,氧化剂压力和肾小管细胞凋亡gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}。肾小管上皮细胞的细胞凋亡导致肾脏固有细胞的损失导致肾脏损害和肾功能下降。一些证据显示线粒体ROS的生成起着重要的作用,易受ROS-induced损伤和从受损的线粒体细胞色素C的释放在引发细胞凋亡过程中发挥作用的DNgydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。我们的研究结果显示,细胞色素C,海拔pro-apoptotic蛋白质伯灵顿,裂解caspase-3并从db / db小鼠肾脏细胞凋亡增加与该模型相一致。虽然GTS-21对抗pro-apoptotic线粒体损伤和环境,减少细胞凋亡从db / db小鼠肾脏,血糖控制的相对重要性与氧化应激,或者两者都需要进一步的研究。gydF4y2Ba

GTS-21的抗炎作用和帽子也可能是重要的机制的有利影响GTS-21 DN。il - 6水平的增加,HMGB1观察肾脏从db / db老鼠和他们的减少GTS-21支持抗炎的作用机制。α7nAChR受体激动剂的抗炎作用是众多研究的支持,其中包括Chatterjee等人谁显示GTS-21变弱inflammation-induced有限合伙人的肾损伤gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。激活α7nAChR似乎抑制炎症的几种机制gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。在一个模型中,α7nAChR激活员工和激活Janus激酶2 (JAK2)导致JAK2自身磷酸化。JAK2新兵和磷酸化信号传感器和转录激活3 (STAT3)导致的核易位和抑制核转录因子kappa-light-chain-enhancer激活B细胞(NF-κB)炎症通路。的Upregulation interleukin-1 receptor-associated激酶M (IRAK-M)提出另一个尼古丁的抗炎作用机制Maldifassi et al。gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。进一步的研究将是必要的,以确定的精确机制GTS-21变弱炎症DN。gydF4y2Ba

PI3K通路已经涉及到葡萄糖监管和我们实验室以前的工作显示GTS-21激活PI3K / AKT / mTOR在L细胞信号通路gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。磷酸化的减少总PI3K和AKT表明这信号通路从db / db小鼠肾脏中表达下调。这一发现与先前的研究表明有些矛盾的角色PI3K / AKT通路在DN的间质纤维化gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba}。然而,PI3K / AKT信号增加GTS-21治疗肾脏从非肥胖老鼠在培养L细胞与我们的结果是一致的gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。实验条件的差异可能有助于解释关于PI3K通路在DN冲突的结果。相反,我们的结果显示p38 MAPK激活肾脏从db / db老鼠符合工作Lim等人表明p38 MAPK通路的激活在DN的发病机制是重要的db / db小鼠模型gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。GTS-21能力减弱p38 MAPK通路和DN与先前的工作相符p38 MAPK激活的抑制MAP激酶激酶(MKK) 3基因敲除小鼠在db / db老鼠也变弱肾损伤gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

对我们的研究有几个局限性。首先,瘦素受体的突变在人类肥胖和2型糖尿病的一个罕见的原因。此外,db / db模型仅限于温和蛋白尿和系膜扩张不明显的肾小球硬化症gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}。因此,我们的研究结果可能没有完全转化为人类的处境。另一个限制是我们未能收集尿液化验蛋白尿,一个典型的发现在DN。虽然我们展示GTS-21改善许多变化在db / db肾脏DN(如炎症、系膜基质扩张,细胞凋亡,p38 MAPK信号)我们的实验不是为了显示因果关系或完全描绘的确切机制改善2型糖尿病和DN。进一步的研究将需要完全阐明α7nAChR受体激动剂的机制减弱实验DN的db / db模式。gydF4y2Ba

我们的研究结果提供证据α7nAChR受体激动剂减弱diabetes-induced db / db的肾损伤模型,可以作为一种新颖的方式改善DN患者2型糖尿病的进展。gydF4y2Ba

动物模型gydF4y2Ba

我们对老鼠的研究机构批准的纽约州立大学上州医科大学动物保健和使用委员会(IACUC # 423)。研究进行符合国家卫生研究院和到实验动物的使用指南。杂合的LeprgydF4y2Ba^{db / +gydF4y2Ba}老鼠(C57BLKS遗传背景)从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。纯合子LeprgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}老鼠繁殖得到的杂合的老鼠,这样的研究可以进行同时在Lepr GTS-21行动是评估gydF4y2Ba^{db / +gydF4y2Ba}和LeprgydF4y2Ba^{db / dbgydF4y2Ba}同窝出生仔畜老鼠。培育的老鼠进行动物核心设施位于纽约州立大学上州医科大学。老鼠被安置在一个温度控制在22°C在无菌条件下。雄性和雌性老鼠的年龄在10 - 12周被用于这项研究。gydF4y2Ba

GTS-21药物传输协议gydF4y2Ba

老鼠在10 - 12周的年龄被分为4组:(1)db / +车辆,(2)db / + GTS-21 db / db车辆,和(4)db / db GTS-21。这些组的小鼠腹腔内注射(IP)一天两次(B.I.D.) 8周的车辆或GTS-21(4毫克/公斤)测试解决方案。血液样本收集和冻结在−80°C进行后续分析。肾脏是收集和瞬间冷冻在液态氮,或者在中性10%福尔马林固定。gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验(ELISA)gydF4y2Ba

血液样本在2500×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟,等离子体的测量收集血液尿素氮(阿伯化验),肌酐(阿伯化验)KIM-1(研发系统),NGAL(研发系统),il - 6(热费希尔科学)和HMGB-1 (MyBioSource, Inc .)gydF4y2Ba

组织学gydF4y2Ba

石蜡包埋的过碘酸希夫染色肾脏部分(5µm厚)进行报道gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba从热科学使用工具(猫。#:87007)。gydF4y2Ba

短暂,(1)部分deparaffinized和水化水然后在0.5%高碘酸氧化解决方案5分钟。(2)部分在蒸馏水冲洗,把希夫试剂15分钟,然后在不冷不热的自来水洗5分钟。(3)复染色的部分是迈耶的苏木精为1分钟,然后在自来水洗5分钟。(4)部分使用CYTOSEAL脱水和覆盖gydF4y2Ba^tmgydF4y2Ba60岁(猫。#:8310 - 4,热科学)。数字图像从20肾小球/动物使用400×放大在显微镜下(尼康,梅尔维尔,纽约)评估肾病理交替。相对系膜基质面积计算根据之前使用图像的方法提出了JgydF4y2Ba^13gydF4y2Ba。相对系膜基质面积(%)被定义为系膜增殖区的部分区域(PAS-positive和nuclei-free肾小球膜面积)对肾小球面积(包括肾小球的毛细血管袢)的边缘。gydF4y2Ba

免疫印迹分析gydF4y2Ba

组织孵化了蛋白质裂解缓冲在4°C为30分钟,然后在13000转离心5分钟沉积物细胞碎片。上层清液收集用于免疫印迹。同样数量(20µg)的蛋白质被加载,通过sds - page分离,然后转移到PVDF膜(猫。#:IPVH00010,微孔有限公司,美国)。膜被封锁的5%脱脂牛奶(猫。#:MI17200、研究产品国际)在Tris-buffered TBS + 0.5% Tween-20(猫。#:BP337,费舍尔科学)1 h在室温和孵化一夜之间在4°C表示主要抗体。总p38 (t-p38 1:1,000,猫。#:8690),phospho-p38 (p-p38 1:1,000,猫。#:9211)和phospho-PI3K (p-PI3K, 4228)从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国); cleaved caspase-3 (1:100, Cat. #: 56053), Bcl-2 (1:200, Cat. #: sc-7382), Bax (1:200, Cat. #: sc-7480), total AKT (t-AKT, 1:500, Cat. #: sc-81434), Phospho-AKT (p-AKT, 1:400, Cat. #: sc-377556), total PI3K (t-PI3K, 1:200, Cat. #: sc-1637) and β-actin (1:4,000, Cat. #: sc-47778) were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). After primary antibody incubation, the blot was incubated with HRP-conjugated secondary antibody for 1 h at room temperature. Antibody-antigen complexes were visualized with ECL (Cat. #: 34580, Thermo Scientific, IL) and analyzed quantitatively by densitometry with Image J software. The relative density of immunoreactive bands was normalized to the density of the corresponding β-actin.

评估凋亡细胞gydF4y2Ba

检测肾凋亡细胞原位转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)工具包(猫。#:C10617,表达载体,尤金,或根据制造商的指示。简单,部分deparaffinized二甲苯,通过梯度酒精脱水系列水,与透化作用和治疗方案。标记反应是包含末端转移酶的使用解决方案执行。染色后,部分被fluoroshield安装安装介质与DAPI(猫。#:ab104139 Abcam公司Cambridge, MA)可视化细胞核。凋亡细胞被TUNEL阳性细胞计数量化从五个连续随机选择字段400放大蒙蔽的方式由两名有经验的调查人员。计算凋亡指数随着TUNEL阳性细胞数量的细胞总数的百分数表示。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据表示为均值±SEM(与高斯分布)或中位数±四分位范围(没有高斯分布)分析使用GraphPad棱镜9。Mann-Whitney测试或gydF4y2BatgydF4y2Ba测试被用来比较两个独立的团体之间的差异。单向方差分析(ANOVA)与Bonferroni多个比较测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的多重比较测试被用来确定多个组的差异。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05的值被认为是重要的。数据来自三个或更多独立的实验。gydF4y2Ba