Lacticaseibacillus喂食gydF4y2BaProbio-M9可以延长动物的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba

心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等疾病的发病率和死亡率与年龄呈显著正相关gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba．因此，延长寿命和延缓衰老的努力受到了广泛关注。许多研究都集中在特定饮食和营养资源在抗衰老方面的关键作用，特别是益生菌补充gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}．活微生物益生菌在摄入足量时具有对人体健康有益的功能gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．研究表明，益生菌通过改善肠道微生物平衡来促进宿主的健康gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}增强免疫调节gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}和/或与病原体竞争gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．然而，益生菌延长宿主寿命的机制在很大程度上仍然难以捉摸。gydF4y2Ba

的线虫gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba在抗衰老研究中，它是一种被广泛使用和成功的模式生物，因为它有明显的优势，包括它的寿命短且易于监测gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}以及伦理问题的缺失gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．调节衰老过程的基因gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba包括一些在脊椎动物中也发现的经典和保守的信号通路。p38有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是最古老的进化保守通路之一gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．在人类中，p38级联通常由炎症细胞因子和病原体入侵激活gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}．在gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba， p38级联被NSY-1 MAPK激酶、SEK-1 MAPK激酶和PMK-1激活gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．胰岛素/胰岛素样生长因子1 (IGF-1)信号通路(IIS)的一些保守成分也调节衰老。由老年基因编码的唯一胰岛素/IGF-1受体gydF4y2Badaf - 2gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba是IIS的关键上游成分，调节各种生理过程，如衰老和成人寿命在gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}．延长寿命的效果gydF4y2Badaf - 2gydF4y2Ba都是通过gydF4y2Badaf-16gydF4y2Ba/FOXO转录因子在胰岛素信号突变体如gydF4y2Badaf - 2gydF4y2Ba（gydF4y2Bae1370gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．SKN-1是一种应激反应性核转录因子，有助于减少iis相关的寿命gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．此外，细菌代谢物分泌的某些物质，如可拉酸、胍丁胺和甲基乙二醛，已被确定为对宿主寿命有重大影响的关键因素gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

线粒体功能对衰老过程有着深远的影响gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．研究表明，线粒体功能障碍对小鼠的寿命有有益的影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}．导致电子传递链(ETC)功能障碍的突变可使蠕虫的寿命延长50%gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．线粒体未折叠蛋白反应(UPRgydF4y2Ba^太gydF4y2Ba)也与促进健康和线粒体稳态有关gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．UPRgydF4y2Ba^太gydF4y2Ba当转录因子ATFS-1在线粒体应激下从线粒体穿梭到细胞核时被激活gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在本研究中，我们探讨了益生菌的作用gydF4y2BaLacticaseibacillus喂食gydF4y2BaProbio-M9是一种从健康母乳中分离出来的益生菌，对人的寿命、运动能力和脂褐素积累等生理功能有重要影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．以Probio-M9喂养的条件显著延长了蠕虫的寿命。使用各种老化相关的突变体gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba包括信号转导，包括p38 MAPK的突变，营养感应信号通路和UPRgydF4y2Ba^太gydF4y2Ba我们利用Probio-M9研究了延长寿命的分子机制。结合Probio-M9代谢产物的差异表达，我们的研究揭示了Probio-M9延缓宿主衰老的可能代谢途径。这些数据揭示了益生菌与宿主寿命之间的重要联系，为益生菌的持续发展提供了新的见解，并表明膳食补充益生菌可能有延缓宿主衰老的潜力。gydF4y2Ba

Probio-M9可以延长动物的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba

Probio-M9和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50属于不同的细菌属，有报道称线虫在正常食物时表现出偏好gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50 (gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50)被其他细菌取代gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}．因此，Probio-M9沉淀重悬于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50方案优先排除蠕虫。在这项研究中，我们使用了大约1:4的比例gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50到Probio-M9(活板计数:6.8 × 10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU/mL和2.82 × 10gydF4y2Ba^9gydF4y2BaCFU/mL)为实验组(OP50 + Probio-M9)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50单独作为对照组(OP50)。首先，我们使用选择分析来探索蠕虫是否更喜欢OP50而不是OP50 + Probio-M9。在OP50上将虫卵培养至L4晚期(补充图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)或OP50 + Probio-M9(补充图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)，然后在转移到OP50或OP50 + Probio-M9 1小时或2小时后观察。结果表明，每个平板上的蠕虫数量基本相同(补充图。gydF4y2Ba1 b, dgydF4y2Ba)，暗示gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba在OP50和OP50 + Probio-M9之间没有表现出偏好。我们还进行了二元选择分析。在OP50上将虫卵培养至L4晚期(补充图)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)或OP50 + Probio-M9(补充图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)，然后转移到有两个OP50和OP50 + Probio-M9细菌草坪的培养皿中。同样，饲喂1 h和2 h后，每块草坪上的蚯蚓数量也没有显著差异(补充图。gydF4y2Ba1 f、hgydF4y2Ba)．这些结果表明，蠕虫对OP50 + Probio-M9没有表现出任何回避行为或偏好。综上所述，这些结果表明，Probio-M9是一种合适的膳食补充剂gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

接下来，我们评估了Probio-M9对小鼠寿命的影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．同步的L4晚期蠕虫从OP50转移到OP50 + Probio-M9或继续在OP50上培养，每天测量生存，直到所有蠕虫死亡。结果表明，OP50 + Probio-M9显著延长了约30%的蠕虫寿命(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．当改变Probio-M9在细菌混合物中的比例(稀释或增加)时，仍然可以观察到寿命的延长(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)，但在OP50: Probio-M9 (OP50 + Probio-M9) 1:4的比例下最优，表明Probio-M9的有益作用具有剂量依赖性。gydF4y2Ba

Probio-M9具有促进健康的作用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba

饮食限制(DR)是众所周知的延缓发育gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，从而延长其寿命gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．目的:探讨饲喂Probio-M9对大鼠生长发育的影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，我们研究了生命周期、雏窝大小和身体大小。在OP50 + Probio-M9上培养不影响达到繁殖年龄所需的时间，也不影响蠕虫的繁殖能力或周期(图50)。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba)．OP50 + Probio-M9也不影响蠕虫的体型(图5)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．此外，我们还研究了DR信号通路在小鼠寿命延长中的作用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．我们发现OP50 + Probio-M9仍然延长了小鼠的寿命gydF4y2Ba吃2gydF4y2Ba（gydF4y2Baad1116gydF4y2Ba),gydF4y2Baaak-2gydF4y2Ba（gydF4y2Baok524gydF4y2Ba)突变虫(图;gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．总之，这些数据表明，用Probio-M9喂养蠕虫对它们的生长和发育没有影响，这表明Probio-M9延长了蠕虫的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba以独立于dr的方式。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，肌肉功能下降、脂褐素积累与衰老密切相关。为了研究喂养Probio-M9是否可以改善这些生理功能，我们测量了与衰老相关的三种经典表型。两组虫的咽泵速率随年龄增长而逐渐下降，饲喂OP50 + pro生物- m9对幼龄期第2、4天的咽泵速率无显著影响，但显著延缓了成年期第6 ~ 14天的咽泵速率下降(图5)。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．与咽部泵血速率的变化一致，OP50 + Probio-M9喂养也延缓了蠕虫正常运动能力的下降(图5)。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)．此外，我们发现，与喂食OP50和OP50的蠕虫相比，喂食OP50 + Probio-M9的蠕虫在成年后第10天和第15天，脂褐素(一种在衰老细胞中积累的自荧光化合物)的积累显著减少。gydF4y2Ba2 i, jgydF4y2Ba)．这些发现表明，喂养Probio-M9有助于保持较高的肌肉质量，并增强老年蠕虫的身体功能。gydF4y2Ba

由于寿命和抗逆性是相互关联的，我们还研究了Probio-M9在抗物理(温度)胁迫方面的作用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．成年第5天，在34°C的高温下暴露18或24小时后，喂食OP50 + Probio-M9的蠕虫的存活率明显高于喂食OP50的蠕虫(图2)。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba)．这些结果表明，Probio-M9对玉米的热稳定性有积极的影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．总之，我们的数据表明，喂养Probio-M9改善了蠕虫的健康状况，延长了它们的寿命。gydF4y2Ba

Probio-M9的健康促进作用取决于它与宿主肠道的粘附性gydF4y2Ba

几种不同的标准被用来筛选潜在的益生菌菌株。益生菌与肠道上皮细胞的粘附以及肠道内益生菌的积累是维持宿主肠道菌群稳态的重要前提gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba．评价Probio-M9对大鼠肠道健康的影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，我们研究了OP50 + Probio-M9在特定发育阶段的喂养干预对蠕虫寿命的影响，并测试了Probio-M9在蠕虫肠道中的粘附性。用OP50 + Probio-M9培养到L4期或成年期(L4后第2天或第4天)的虫卵衍生的蠕虫与用OP50喂养的虫卵相比，表现出明显更长的寿命延长(图5)。gydF4y2Ba3 a egydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)．我们还发现，在OP50 + Probio-M9上从卵培养到成虫(L4后第4天)的蠕虫寿命明显长于在OP50 + Probio-M9上从卵培养到L4期的蠕虫(图5)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)．这些结果表明，在发育周期中，延长寿命的程度取决于饲喂Probio-M9的时机gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

验证Probio-M9在肠道中的存在gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，我们评估了Probio-M9在成年后第5天和第10天粘附在蠕虫肠道的能力。在暴露于OP50 + Probio-M9 5或10天后，使用菌落形成单位总数(CFU)来确定肠道中积累的细菌数量。第5天和第10天Probio-M9的数量(分别为217 CFU/mL/worm和793 CFU/mL/worm)与阳性对照组相当gydF4y2BaLacticaseibacillus喂食gydF4y2BaGG (LGG，分别为166 CFU/mL/worm和872 CFU/mL/worm)gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．为了确认Probio-M9留在肠道中，喂食OP50 + Probio-M9或OP50 + LGG的第10天蠕虫被转移到OP50，持续3天。在之前喂食OP50 + Probio-M9的组中，Probio-M9菌落总数为667 CFU/mL/条虫，与LGG组的747 CFU/mL/条虫相似(图5)。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．这些结果表明，Probio-M9在小鼠肠道内得到了维持gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba并有助于宿主的健康寿命。gydF4y2Ba

此外，我们还研究了热灭活Probio-M9(95°C 30分钟)对小鼠寿命的影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．我们发现，OP50 +热灭活Probio-M9不能延长蠕虫的寿命(图5)。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)，说明Probio-M9必须处于活态，才能对宿主的健康寿命产生有益影响。综上所述，这些结果表明，Probio-M9的健康促进作用包括粘附在肠道gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Probio-M9通过p38 MAPK信号通路起作用gydF4y2Ba

为了了解与Probio-M9喂养相关的长寿分子机制，我们探索了p38信号通路，这是一个保守的MAPK亚家族信号通路，在宿主寿命调节中起着关键作用gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．使用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba我们首先研究了p38信号通路中的三个关键因子NSY-1、SEK-1和PMK-1是否与饲喂Probio-M9诱导的宿主寿命有关。有趣的是，我们发现gydF4y2Bansy-1gydF4y2Ba（gydF4y2Baag3gydF4y2Ba),gydF4y2Bapmk-1gydF4y2Ba（gydF4y2Bakm25gydF4y2Ba)突变几乎完全抑制了与Probio-M9喂养相关的寿命延长，gydF4y2Basek-1gydF4y2Ba（gydF4y2Bakm4gydF4y2Ba)突变强烈但不完全抑制了寿命(N2组寿命延长~30% vsgydF4y2Basek-1gydF4y2Ba突变体)(无花果。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，表明gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Bap38级联参与了Probio-M9介导的寿命延长。gydF4y2Ba

为了进一步验证p38信号通路的参与，我们评估了Probio-M9对两个toll -白细胞介素-1耐药(TIR-1)结构域蛋白突变体寿命的影响gydF4y2Batir-1gydF4y2Ba（gydF4y2Batm3036gydF4y2Ba),gydF4y2Batir-1gydF4y2Ba（gydF4y2Baok1052gydF4y2Ba)，其功能在PMK-1的上游gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．同样，OP50 + Probio-M9也不能延长任何突变体的寿命(图5)。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．为了进一步证实，我们探索了Probio-M9对ATF-7的影响，ATF-7是p38信号通路中PMK-1下游的转录因子。同样，OP50 + Probio-M9不能延长小鼠的寿命gydF4y2Baatf-7gydF4y2Ba（gydF4y2Bagk715gydF4y2Ba)突变虫(图;gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，提示Probio-M9可能通过PMK-1激活ATF-7，延长ATF-7的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．总之，我们的数据表明，Probio-M9对延长寿命的影响gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba需要p38信号通路。gydF4y2Ba

Probio-M9下调胰岛素样信号通路gydF4y2Ba

宿主与益生菌之间的相互作用是复杂的、多因素的gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．我们想知道Probio-M9是否可能通过宿主体内一种众所周知的营养感应机制起作用。使用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba利用IIS中的功能丧失突变体和雷帕霉素(TOR)信号通路的靶点，我们通过喂养Probio-M9来研究这些宿主因素是否与宿主寿命相关。在测试的四种突变体中，只有gydF4y2Badaf - 2gydF4y2Ba（gydF4y2Bae1370gydF4y2Ba)突变体在喂食OP50 + Probio-M9后未能表现出延长寿命(图5)。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba及补充表格gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．提示Probio-M9延长寿命的机制与IIS信号通路有关，而与TOR信号通路无关gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

DAF-2是IIS的上游组成部分，调节多种生理过程gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．为了确定Probio-M9如何与IIS信号通路相互作用以调节寿命，我们研究了DAF-2下游转录因子HSF-1(热休克转录因子1)，SKN-1/核因子红系2 (NRF2)和DAF-16/FOXO在延长寿命中的潜在参与。我们发现probio - m9介导的延伸gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba寿命独立于DAF-16，但依赖于SKN-1和HSF-1(图2)。gydF4y2Ba5汉英gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，提示SKN-1和HSF-1可能是Probio-M9长寿效应的必要条件。gydF4y2Ba

SKN-1和HSF-1作为抗逆境转录因子gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}．为了确认喂养Probio-M9是否能提高抗逆性和延长寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba在美国，我们调查了两名GFP记者gydF4y2Baskn-1:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba的转录靶点gydF4y2Baskn-1gydF4y2Ba),gydF4y2Bahsp - 16.2 - p:: gfpgydF4y2Ba的直接转录靶点gydF4y2Bahsf-1gydF4y2Ba)分别反映SKN-1和HSF-1的抗逆性。我们的研究结果表明gydF4y2Baskn-1:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在喂食OP50 + Probio-M9的蠕虫肠道中增加，但对肠道无影响gydF4y2Bahsp - 16.2 - p:: gfpgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5外:我gydF4y2Ba)．此外，我们检测了SKN-1活性指标GST-4的表达gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba，结果表明gydF4y2Bagst-4p:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在增加gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba用OP50 + Probio-M9喂养的小鼠，与用OP50喂养的小鼠相比(图5)。gydF4y2Ba5 j, kgydF4y2Ba)．综上所述，这些结果表明，Probio-M9对寿命延长和抗逆性的影响是通过a来实现的gydF4y2Baskn-1gydF4y2Ba端依赖但gydF4y2Bahsf-1gydF4y2Ba独立的机制。gydF4y2Ba

Probio-M9作用于宿主线粒体以促进长寿gydF4y2Ba

为了进一步探讨Probio-M9抗胁迫作用的分子机制，我们研究了另外两种细胞器特异性应激反应:内质网未折叠蛋白反应(UPR)gydF4y2Ba^呃gydF4y2Ba)及普遍定期审议gydF4y2Ba^太gydF4y2Ba．在UPR中，Probio-M9不影响胁迫基因GFP报告基因的诱导gydF4y2Ba^呃gydF4y2Ba（gydF4y2Bahsp-4p:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba)(补充图gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)，它确实对线粒体应激有影响。的表达式gydF4y2Bahsp-6p:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在喂食OP50 + Probio-M9的蠕虫的肠道和尾部增加(图5)。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)，表明喂食Probio-M9可诱导UPRgydF4y2Ba^太gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

确认已知激活普遍定期审议的分子成分的参与gydF4y2Ba^太gydF4y2Ba，我们首先检查了UPR中的关键转录因子ATFS-1gydF4y2Ba^太gydF4y2Ba监管。正如预期的那样，OP50 + Probio-M9不能延长功能丧失的寿命gydF4y2Baatfs-1gydF4y2Ba（gydF4y2Bagk3094gydF4y2Ba)突变体(图;gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．我们还研究了Probio-M9对功能丧失突变体的影响gydF4y2Baisp-1gydF4y2Ba（gydF4y2Baqm150gydF4y2Ba),gydF4y2Banuo-6gydF4y2Ba（gydF4y2Baqm200gydF4y2Ba)，以评估ETC的成分ISP-1和nos -6是否与probio - m9介导的宿主寿命的促进有关。同样，OP50 + Probio-M9不能延长小鼠的寿命gydF4y2Baisp-1gydF4y2Ba（gydF4y2Baqm150gydF4y2Ba)或gydF4y2Banuo-6gydF4y2Ba（gydF4y2Baqm200gydF4y2Ba)突变体(图;gydF4y2Ba6 d, egydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，表明Probio-M9的延长寿命作用与线粒体功能降低的促长寿作用趋于一致gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．这些结果表明，Probio-M9通过提高UPR来延长宿主的寿命gydF4y2Ba^太gydF4y2Ba从而维持肠细胞中的线粒体稳态。gydF4y2Ba

为了评估Probio-M9对线粒体膜电位的影响，我们使用线粒体特异性荧光染料，四甲基罗丹明乙酯(TMRE)，对蠕虫染色。与OP50相比，喂食OP50 + Probio-M9的蠕虫咽部鳞茎的TMRE荧光强度显著增加(图5)。gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba)，表明Probio-M9增加了宿主的线粒体膜电位。由于穿过细胞膜的膜电位是线粒体产生ATP的主要驱动力，Probio-M9的喂养可能有助于ATP的产生和储存在细胞和体内gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

OP50与Probio-M9差异代谢产物的鉴定与分析gydF4y2Ba

为了阐明Probio-M9介导长寿的机制，我们使用超高效液相色谱-质谱进行了代谢组学分析，以确定OP50和Probio-M9之间的差异调控代谢物。采用总离子色谱(TIC)和主成分分析(PCA)对实验收集的质控(QC)细菌数据进行分析和评价。在正模式和负模式下测试样品的TIC。当比较每个色谱峰的保留时间和强度时，这些分析揭示了高水平的叠加，反映了较高的仪器稳定性(补充图。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)．PCA评分显示，混合质控菌(mix01、mix02和mix03)聚集良好，但OP50和OP50 + Probio-M9分离，说明实验条件和获得的数据重复性稳定可靠(Supplementary Fig。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

共鉴定并定量了1253种代谢物。使用PCA、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型和热图来评估OP50和OP50 + Probio-M9之间的代谢变化。PCA评分、OPLS-DA评分图和热图显示OP50和OP50 + Probio-M9分布在不同的区域，没有重叠和交叉，而是有明显的分离(图。gydF4y2Ba7得了gydF4y2Ba)．当代谢物水平同时满足fold change (FC)≤0.5或≥2,variable importance in projection (VIP)评分阈值≥1时，OP50与OP50 + Probio-M9之间差异调节的代谢物被认为具有统计学意义。这些代谢物然后表示使用火山图(图。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)，详情载于补充资料gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．具有显著差异的代谢物主要分为14类，包括氨基酸及其代谢物、羧酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、鞘脂、核苷酸及其代谢物、苯及其衍生物、杂环化合物。Log2FC值在OP50和OP50 + Probio-M9之间的前十位上调和前十位下调代谢产物如图所示。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba，反映了这些途径中代谢物的变化水平。为了将probio - m9相关的变化与代谢途径联系起来，使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径数据库来识别具有显著差异的代谢物的途径富集模式。82种代谢途径被确定为受代谢改变的影响，(补充图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)，其中有20种显著变化的代谢物有助于丰富与色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、铁下垂、半乳糖代谢和鞘脂代谢相关的途径(图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)，表明这些途径可能有助于Probio-M9介导的宿主寿命延长。gydF4y2Ba

这项研究揭示了用gydF4y2BaLacticaseibacillus喂食gydF4y2BaProbio-M9是从健康母乳中分离出来的，可以延长模式生物的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．我们发现，喂食活的Probio-M9，而不是热灭活的Probio-M9，改善了蠕虫的健康状况。Probio-M9延长了小鼠的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba通过调节p38级联和gydF4y2Badaf - 2gydF4y2Ba信号通路，独立于gydF4y2Badaf-16gydF4y2Ba而是依赖于gydF4y2Baskn-1gydF4y2Ba．通过启动普遍定期审议gydF4y2Ba^太gydF4y2Ba，它似乎还能保护和修复受损的线粒体，以维持代谢稳定。同时，氨基酸代谢、鞘脂代谢、半乳糖代谢和脂肪酸代谢可能参与了probio - m9介导的长寿gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

据报道，益生菌通过改善肠道微生态平衡对宿主有益gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}调节免疫系统gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba}并附着在肠道上gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba．我们之前报道过Probio-M9在体外高胆盐或低pH值条件下存活的能力gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．此外，我们发现Probio-M9通过调节肠道环境和改善炎症反应来抑制小鼠结直肠肿瘤的形成gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

DR已被证明可以延长许多物种的寿命和延缓衰老gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}．虽然DR可以延长患者的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，在DR下的蠕虫比正常饮食下的蠕虫体积更小gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba．在本研究中，喂食OP50 + Probio-M9的蠕虫的体型和发育正常，发育周期与喂食OP50的相似。此外，OP50 + Probio-M9喂养延长了功能丧失的寿命gydF4y2Ba吃2gydF4y2Ba（gydF4y2Baad1116gydF4y2Ba),gydF4y2Baaak-2gydF4y2Ba（gydF4y2Baok524gydF4y2Ba)突变体的DR信号通路，表明Probio-M9延长了小鼠的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba以独立于dr的方式。与这些发现一致的是，gydF4y2Ba加氏乳杆菌gydF4y2BaSBT2055被证明可以延长动物的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba以药物独立的方式降低了37%gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

肌肉功能下降和脂褐素积累与衰老密切相关gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba}．我们的研究表明，喂养Probio-M9增强了老年蠕虫的运动能力，减少了脂褐素的积累，这表明Probio-M9改善了宿主的健康寿命，延长了它们的寿命。这与之前的报道一致gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba也增加运动能力和降低脂褐素的积累在年老的蠕虫gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．此外，在成虫第5天时，OP50 + Probio-M9组在高温(34°C)下的存活率明显高于OP50组，说明饲喂Probio-M9组增强了蠕虫的耐受环境应激能力。与我们的发现一致，gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaNCIB3610被证明可以延长小鼠的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba通过增强对热胁迫、渗透胁迫、金属胁迫和HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}OgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}氧化应激gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba．本研究表明，喂养Probio-M9可以增强应激反应，延长寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，为进一步研究Probio-M9延缓宿主衰老过程提供了理论基础。gydF4y2Ba

因为肠细胞gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba在结构上与人类相似，它们被认为是探索肠道内细菌-宿主通信的理想工具gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．能够粘附在肠粘膜上，是有害细菌和有益细菌在体内定植和产生生理或病理生理作用的先决条件，是筛选益生菌菌株和减少有害细菌积累的关键指标。一些研究表明，有益细菌有助于维持肠道微生物群的稳态，从而促进宿主的健康gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba}．然而,当gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba被用作唯一的膳食补充剂gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba的数目增加gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在蠕虫肠有助于增加致病性和加速老化的蠕虫gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba．我们的研究还表明，Probio-M9所赋予的寿命延长程度取决于Probio-M9喂养的时间。此外，我们的定量CFU试验显示，从OP50 + Probio-M9转向OP50喂养后，Probio-M9在蠕虫体内继续存在，与阳性对照LGG相似。这些结果也与之前的报告一致，其中平板计数和透射电镜分析显示gydF4y2BaLimosilactobacillus酵母gydF4y2BaJDFM216粘附于小鼠肠道gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．然而，OP50 +热灭活的Probio-M9无法延长蠕虫的寿命，这表明处于活跃状态的Probio-M9对宿主健康有有益的影响，可以延长蠕虫的寿命，这与益生菌的定义一致gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．相比之下，之前的一份报告显示BgydF4y2Baifidobacterium longeumgydF4y2Ba无性系种群。gydF4y2BalongeumgydF4y2Ba在95°C下热灭活30分钟的BB68显著延长了28%的蠕虫寿命gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba这表明益生菌可能具有菌株特异性。总之，我们的研究结果表明，Probio-M9对促进健康和长寿有有益的作用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba这些作用依赖于Probio-M9粘附在蠕虫肠道上。gydF4y2Ba

众所周知，衰老是一个涉及多种信号通路相互作用的复杂过程gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba}包括p38信号通路，这是一种调节宿主寿命的关键信号通路gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．我们的研究结果表明，OP50 + Probio-M9不能延长功能丧失的寿命gydF4y2Bapmk-1gydF4y2Ba突变，表明p38级联可能与Probio-M9摄食相关的寿命有关，这与之前的一份报告一致gydF4y2BaLacticaseibacillus喂食gydF4y2Ba延长寿命的GGgydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba通过激活gydF4y2Bapmk-1gydF4y2Ba(p38 MAPK)信号通路gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba．TIR-1效应蛋白可激活下游PMK-1信号通路gydF4y2Ba^{63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba}．我们的数据表明，OP50 + Probio-M9通过激活p38信号通路上游的TIR-1来延长蠕虫的寿命。相关研究也证实了这一点gydF4y2Ba嗜酸乳杆菌gydF4y2BaNCFM激活gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba免疫反应gydF4y2Ba粪肠球菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba通过TIR-1和PMK-1免疫信号通路，延缓宿主衰老gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．此外，作用于p38信号通路下游的ATF-7具有双重免疫调节作用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．ATF-7抑制免疫相关基因的转录。然而，当p38 (PMK-1)磷酸化发生时，这种抑制被消除，之后ATF-7作为激活剂，促进免疫基因的激活gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．我们还观察到OP50 + Probio-M9不能延长功能丧失的寿命gydF4y2Baatf-7gydF4y2Ba提示先天免疫模式识别系统可能参与了probio - m9激活的p38级联。通常gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba被用作唯一的膳食补充剂gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba文化;然而，繁殖的细菌可能对较老的蠕虫具有致病性gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba．因此，摄入Probio-M9可能通过PMK-1激活宿主防御系统，发挥其促进健康的作用。在未来的研究中，我们计划比较转录组和代谢组gydF4y2Bapmk-1gydF4y2Ba以OP50 + Probio-M9喂养的突变型和野生型N2蠕虫，可能揭示OP50 + Probio-M9调控的基因和相关代谢产物gydF4y2Bapmk-1gydF4y2Ba有助于延缓衰老。gydF4y2Ba

SKN-1控制抗应激的特定途径，也广泛参与免疫反应、代谢和解毒gydF4y2Ba^67gydF4y2Ba．Kato等人证明了这一点gydF4y2Babutyricum梭状芽胞杆菌gydF4y2BaMIYAIRI 588能提高抗逆性，延长寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba通过gydF4y2Baskn-1gydF4y2Ba^68gydF4y2Ba．我们的结果表明，OP50 + Probio-M9不能延长功能丧失的寿命gydF4y2Baskn-1gydF4y2Ba突变，表明SKN-1可能是probio - m9介导的寿命延长所必需的。SKN-1已被证明可被DAF-2直接抑制gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba而通过SKN-1活性的DAF-2信号通路可能调控了喂食Probio-M9的蠕虫的寿命。Bishop和Guarente揭示了SKN-1的抗应激功能是由其在肠道中的表达介导的gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba．我们的结果表明，与OP50相比，OP50 + probio - m9喂养的蠕虫肠道中SKN-1的荧光强度显著增强。此外，OP50 + Probio-M9的饲喂增加了gydF4y2Bagst-4p:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba的下游目标gydF4y2Baskn-1gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba这表明，喂养Probio-M9激活了SKN-1，从而有助于提高抗逆性和延长寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．与我们的发现一致，Komura等人发现gydF4y2Ba双歧杆菌属对象gydF4y2Ba喂养可以提高抗逆性，延长寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba通过gydF4y2Baskn-1gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba信号通路。gydF4y2Ba

细胞器线粒体可能起源于细菌;事实上，它们有许多共同的代谢途径gydF4y2Ba^71gydF4y2Ba．线粒体参与衰老过程，作为代谢和重要信号通路的信号枢纽gydF4y2Ba^72gydF4y2Ba．我们的研究结果表明，Probio-M9可增强肠道UPRgydF4y2Ba^太gydF4y2Ba可能是通过线粒体ETC成分ISP-1和noo -6。线粒体ETC复合物功能的降低有助于UPR的激活gydF4y2Ba^太gydF4y2Ba维持线粒体稳态gydF4y2Ba^{73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba}．UPRgydF4y2Ba^太gydF4y2Ba-激活的ATFS-1反过来抑制ETC基因在线粒体基因组中的表达gydF4y2Ba^75gydF4y2Ba．与我们的发现一致，Han等人发现gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba代谢产物柯兰酸(CA)分泌增加的突变体延长了小鼠的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba通过调节宿主线粒体动力学和UPRgydF4y2Ba^太gydF4y2Ba并且纯化的CA聚合物通过ATFS-1延长了蠕虫的寿命gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}．我们的结果表明，ATFS-1也是Probio-M9促进健康作用的关键中介。gydF4y2Ba

细菌代谢产物在宿主衰老过程中起着至关重要的作用gydF4y2Ba^{57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba}．本研究代谢组学分析发现，差异表达的代谢物主要富集在氨基酸代谢、半乳糖代谢、鞘脂代谢、脂肪酸生物合成和cAMP信号通路。氨基酸影响寄主寿命，色氨酸和脯氨酸有助于延缓寄主衰老gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，而苯丙氨酸加速衰老;gydF4y2Ba^78gydF4y2Ba天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸可以延长酵母的寿命gydF4y2Ba^79gydF4y2Ba．我们的结果表明，细菌色氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢物的显著富集可能与寿命的延长有关gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2BaProbio-M9。细菌葡萄糖代谢产物，如葡萄糖、半乳糖和乳糖，也可能与宿主长寿有关，参与抗衰老活动gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba．我们的代谢组学数据表明，细菌半乳糖代谢物的显著富集可能有助于延长小鼠的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2BaProbio-M9。与我们的发现一致，Zanni等人发现半乳糖由gydF4y2Ba乳酸菌delbrueckiigydF4y2Ba无性系种群。gydF4y2BabulgaricusgydF4y2Ba可能与它的有益作用有关gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba^80gydF4y2Ba．鞘脂、神经酰胺等细菌代谢产物的积累与衰老及老年性疾病密切相关gydF4y2Ba^{81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba}．研究表明，鞘脂代谢可能对增强运动能力至关重要gydF4y2Ba^83gydF4y2Ba健康状况的改善gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba这部分依赖于胰岛素受体gydF4y2Badaf - 2gydF4y2Ba信号通路gydF4y2Ba^84gydF4y2Ba．戈雅等人观察到gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba介导宿主鞘脂代谢并被抑制gydF4y2BasyngydF4y2Ba聚集在gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba^85gydF4y2Ba．根据我们的研究结果，我们发现Probio-M9可能通过营养感应调节鞘脂代谢以延长寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．此外，我们的数据显示，OP50 + Probio-M9饲喂后，牛磺酸代谢衍生的2-氨基乙磺酸显著积累。牛磺酸在清除脂质代谢、免疫功能等生理功能方面具有重要意义，是抗炎活性的重要促进剂gydF4y2Ba^{86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba}．然而，这种推断还需要进一步的实验验证。如何提取Probio-M9中最关键的代谢物，并进行进一步的寿命验证实验，以证明益生菌代谢物对宿主的促进健康和延长寿命的作用将是值得关注的。有必要确定益生菌的主要抗衰老成分，并探索益生菌延缓宿主衰老的信号通路。尽管具有挑战性，但未来的研究应侧重于益生菌对哺乳动物寿命的影响，并阐明其作用的分子机制。gydF4y2Ba

秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba菌株和培养gydF4y2Ba

的线虫gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba本研究使用的菌株见补充表gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．线虫在20°C的线虫生长培养基(NGM)琼脂上培养gydF4y2Ba^88gydF4y2Ba按照标准技术，用预先培养的菌株播种gydF4y2Ba^89gydF4y2Ba．雌雄同体的gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba通过分离虫卵来实现年龄同步，然后转移到NGM板上gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

菌株培养条件gydF4y2Ba

在这项研究中，Probio-M9是从健康母乳中分离出来的。gydF4y2BaLacticaseibacillus喂食gydF4y2BaGG (LGG)购自广东省微生物培养保存中心。Probio-M9和LGG在MRS肉汤中37°C厌氧培养24 h，连续培养至三代作为试验菌液。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50在Luria-Bertani (LB)肉汤中37°C孵育12 h，以225 rpm的转速摇晃。gydF4y2Ba

在4000 ×离心下收集Probio-M9和LGG制备供虫食的菌板gydF4y2BaggydF4y2Ba用M9缓冲液(3 g KHgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 6克钠gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}HPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba、5 g NaCl和1 mL 1 M MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)两次，然后重新悬挂gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOp50 (6.8 × 10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU/mL)至终剂量(2.82 × 10gydF4y2Ba^9gydF4y2BaCFU/mL和3.02 × 10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba分别为CFU/mL)，作为菌源。在重新进入之前gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOP50，将浓缩的Probio-M9在95°C下加热30 min，作为热灭活Probio-M9。取40 μL菌液接种于60 mm NGM平板上。gydF4y2Ba

寿命试验gydF4y2Ba

如前所述，所有寿命分析都在20°C下进行gydF4y2Ba^88gydF4y2Ba．L4期晚期的蠕虫作为t = 0进行寿命测定，除非另有说明，否则每两天将其转移到新鲜培养皿中，直到所有蠕虫死亡。在每个实验中，90只蠕虫在3个培养皿上进行细菌菌株测试(每个培养皿30只蠕虫)。蠕虫的存活是按日计算的。停止咽泵和对铂丝钳轻柔的机械刺激无反应者被标记为死亡gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}．意外丢失、挤压器官或显示出杀母体孵化的蠕虫被删减并排除在寿命分析之外。gydF4y2Ba

细菌选择试验gydF4y2Ba

将虫卵在OP50或OP50 + Probio-M9上培养至L4晚期。然后用M9缓冲液清洗这些蠕虫三次。在第一种模式中，将OP50或OP50 + Probio-M9接种在平板的中心，在平板两端的边缘放置50只蠕虫，与OP50或OP50 + Probio-M9等距。在第二种模式中，OP50或OP50 + Probio-M9分别在培养板两端边缘播种，100条蠕虫放置在培养板中心，与OP50和OP50 + Probio-M9等距。让蚯蚓自由活动1小时或2小时，并统计进入每个细菌草坪的蚯蚓数量。gydF4y2Ba

生命周期，窝大小和身体大小测定gydF4y2Ba

按之前的方法测定gydF4y2Ba^{55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

为了确定蠕虫的生命周期，将20个卵放在20个盘子上，以t = 0进行生命周期分析。当蠕虫产下第一颗卵时，也就是完成整个生命周期的时候。gydF4y2Ba

将20只L4晚期的同步雌雄同体虫每日转移到新鲜培养皿中(每盘1只)，直至终止繁殖，计算每只虫的总子代数。gydF4y2Ba

为了测量蚯蚓的身体大小，从成虫1-5天挑选了20只蚯蚓。用25 mM左旋咪唑虫麻醉后使用立体显微镜(ZEISS Axio Imager M2)拍摄照片，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD, USA)进行分析。计算了蠕虫的投影面积，并将其作为身体大小的指标。gydF4y2Ba

咽泵速测定gydF4y2Ba

按上述方法测定了不同年龄蠕虫的咽泵速率gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}．选取成虫第2 ~ 14天，采用SMZ-168立体显微镜(Motic)测定咽泵速。计数30 s间隔内咽部末端球茎处咽部收缩次数。gydF4y2Ba

运动评分gydF4y2Ba

按照之前的方法测定不同年龄的蠕虫的运动性gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba．从成虫的第8-16天开始选择蚯蚓，并测量它们的运动评分。蠕虫的分类是根据运动活动的不同而定的。当蠕虫表现出自发和/或有节奏的正弦运动(正常运动)时，它们被归类为“A”类;运动不规则和/或不协调(不协调/迟缓)的蠕虫，被归类为“B”类;当用铂金线钳进行适度的触摸时，蠕虫只会移动头部和/或尾巴(不能移动身体)，它们被归类为“C”类;死虫被归类为“D”类。每次实验至少对90条蠕虫进行评分。gydF4y2Ba

脂褐素积累试验gydF4y2Ba

按照上述方法检测肠道脂褐素的自身荧光gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．第10天或第15天用M9缓冲液冲洗蠕虫3次，然后用25 mM左旋咪唑麻醉。在共聚焦激光扫描显微镜(Olympus FV1200)中，用蓝色激发光(405 nm)获得脂褐素的自身荧光图像。用ImageJ软件荧光强度定量检测脂褐素的积累水平。gydF4y2Ba

耐热性试验gydF4y2Ba

为了评估耐热性，按照之前的方法测定了蠕虫的存活率gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba．第5天，在34°C下暴露，然后分别在12 h、18 h和24 h后测定存活率。gydF4y2Ba

蠕虫肠道内细菌CFU的测定gydF4y2Ba

按上述方法测定蛔虫肠道中CFU的数量gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba．第5天或第10天，用M9缓冲液清洗蠕虫3次，并将其转移到空的NGM板上1小时，以去除表面附着的细菌。将5条蠕虫放入M9缓冲液中，用玻璃研磨机研磨。用M9缓冲液持续稀释蠕虫裂解液，在MRS板上37℃厌氧培养48 h，计数CFU数量。gydF4y2Ba

根据上述方法测定了蠕虫肠道内的细菌脉冲追赶数gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}．从OP50 + LGG(阳性对照)和OP50 + Probio-M9的NGM培养板中选取成虫第10天，用M9缓冲液冲洗3次，转移到OP50的培养板上。3天后，按上述方法测试CFU的数量。gydF4y2Ba

应力响应的荧光强度分析gydF4y2Ba

荧光表达量按之前的方法测定gydF4y2Ba^92gydF4y2Ba．使用激光共聚焦扫描显微镜(Olympus FV1200)的绿色激发光(473 nm)获得荧光强度图像。利用ImageJ软件分析GFP的荧光强度。gydF4y2Ba

来衡量gydF4y2Bahsp-4p:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba第5天，在含有50 ng/mL束霉素或等量DMSO的M9缓冲液中诱导4 h。来衡量gydF4y2Bahsp - 16.2 - p:: gfpgydF4y2Ba第5天，在34°C下加热20 min，然后恢复6 h。最后，对荧光照片进行了如上所述的分析。gydF4y2Ba

线粒体膜电位的估计gydF4y2Ba

为了评价线粒体膜电位的影响，一种特殊的荧光染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)被用来染色蠕虫。在含有10 μm TMRE的OP50或OP50 + Probio-M9中培养5天，然后放置在含有25 mM左旋咪唑的2%琼脂糖垫上，用激光共聚焦扫描显微镜(Olympus FV1200)的红色激发光(556 nm)拍照。利用ImageJ软件分析图像的荧光强度。gydF4y2Ba

代谢组学分析gydF4y2Ba

对照组(OP50)和试验组(OP50 + Probio-M9)供虫饲料的细菌从NGM板上取M9缓冲液至15 mL离心管中，用M9缓冲液洗涤3次，取50±2 mg，加入冷钢球，30 Hz均质3 min。均质溶液中加入1ml 70%甲醇内标。样品涡旋2 min，冰孵育15 min，然后离心(13,400 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C, 10分钟)。取400 μL上清液入EP管，- 20℃保存过夜。冰封解冻，离心(13,400 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C, 3 min)，在注射瓶衬里取200 μL上清进行机上分析。gydF4y2Ba

代谢组学样本采用UPLC系统(ExionLC AD，gydF4y2Bahttps://sciex.com.cn/gydF4y2Ba)和四极飞行时间(TripleTOF 6600, AB SCIEX)。gydF4y2Ba

样品采用ACQUITY HSS T3 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)在40℃下分离。流动相为流动相A(水加0.1%甲酸，v/v)和流动相B(乙腈加0.1%乙酸，v/v)。洗脱梯度为:95% A ~ 5% B, 0.0 min;10% A至90% B, 10.0 min;95% A到5% B, 14.0分钟。流速为0.35 mL/min，进样量为5 μL。gydF4y2Ba

质谱数据采用软件分析器1.6.3进行处理。利用TIC和多峰多反应监测(MRM)评价代谢物提取和检测的重复性。根据国产元数据数据库(MWDB)等数据库，根据保留时间(RT)和质荷比对信息和二次通用数据进行定性分析。代谢物结构分析参考了几个公共质谱数据库，包括人类代谢组数据库(HMDB)，gydF4y2Bahttp://www.hmdb.ca/gydF4y2Ba)、梅特林(gydF4y2Bahttp://metlin.scripps.edu/index.phpgydF4y2Ba)、massbank (gydF4y2Bahttp://www.massbank.jp/gydF4y2Ba)和背囊(gydF4y2Bahttp://kanaya.naist.jp/knapsack/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

10微升/样品用于代谢组学分析的质量控制(QC)。在色谱柱上运行样品组时，10个样品后注入一个QC样品。使用三重四极杆质谱MRM分析代谢物定量。用多定量软件打开样品机下的质谱文件，对色谱峰进行积分校正。每个色谱峰的峰面积代表相应物质的相对含量。提取并保存色谱峰面积积分数据，使用自制软件包去除代谢物的正离子和负离子。gydF4y2Ba

计算QC样品中代谢物的变异系数(CV)值，剔除CV值大于0.5的代谢物。当代谢物在正离子和负离子模式下都被检测到时，那些cv较大的代谢物在正离子或负离子模式下被去除。采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型分析各组间代谢谱的差异。gydF4y2Ba

统计和再现性gydF4y2Ba

所有结果均来自至少3个生物重复。采用Prism8软件分析寿命曲线，采用Log rank (mantle - cox)方法分析差异的显著性。统计数据，学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba采用χ 2检验、单因素方差分析、双因素方差分析及多重比较进行显著性分析。在所有情况下，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05被认为是显著的。在图中，星号表示Log秩检验，Student 's的统计显著性gydF4y2BatgydF4y2Ba检验、卡方检验、单因素方差分析和双因素方差分析。代谢组学数据使用R包“MetaboAnalyst”应用OPLS-DA模型。采用重复200次的置换试验对模型进行验证gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为可行的OPLS-DA模型。每种代谢物的显著性用Student 's进行测量gydF4y2BatgydF4y2Ba测试和折叠变化，以及单尾学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba使用Fisher精确检验或Fisher精确检验来分析统计显著性，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为差异有统计学意义。利用Benjamini-Hochberg方法，gydF4y2BapgydF4y2Ba值通过错误发现率(FDR)进行多次测试校正。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba