自然产生的SARS-CoV-2缺陷干扰粒子的进化gydF4y2Ba

贝塔冠状病毒是具有重大医学和经济重要性的病原体。在过去20年里，它们造成了三次重大病毒疫情:2003年SARS-CoV和2012年MERS-CoV疫情，以及目前的SARS-CoV-2大流行。冠状病毒是阳性意义的单链RNA病毒，其基因组为26-32 kb。冠状病毒基因组的前三分之二由两个大的开放阅读框(orf)组成，编码在病毒复制中起作用的非结构蛋白。病毒基因组的其余部分包括orf，通过编码结构蛋白和辅助蛋白的不连续转录过程转录成亚基因组mrna。5 '和3 '未翻译区域(utr)包含复制所必需的结构特征gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

正如其他正链RNA病毒所指出的那样，冠状病毒显示出很高的重组率。复制引起的错误，加上冠状病毒基因组之间的重组，增加了病毒库的遗传多样性，导致了新的病毒变体的出现gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，并产生含有大量缺失的缺陷病毒基因组(DVGs)gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．有时，在辅助病毒存在的情况下，会出现能够保持复制和被包装的dvg，这些被称为缺陷干扰(DI)颗粒。自然选择的DI基因组已被鉴定为几种冠状病毒成员，包括小鼠肝炎病毒gydF4y2Ba^{5克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}，传染性肠胃炎病毒gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}，牛冠状病毒gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}，以及传染性支气管炎病毒gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}．此外，最近设计了基于人类229E和SARS-CoV-2冠状病毒基因组的合成DIs，并证明能够在体外和体内降低病毒基因组RNA (gRNA)水平或病毒滴度gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}；可能是与亲代病毒竞争限制细胞和/或病毒资源的结果gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．对自然产生的DIs的描述特别有见解，因为它们定义了在亲本病毒存在的情况下扩增突变基因组时施加的选择压力的后果，从而深入了解与亲本病毒稳定共繁殖所需的遗传信息。本文报道了SARS-CoV-2 DI颗粒的分离和功能表征。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2 dvg的分离与鉴定gydF4y2Ba

为了选择自然形成的DIs，将SARS-CoV-2以3 pfu/细胞的速度连续传代30次(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．传代过程中病毒滴度评估显示感染性病毒产量下降;与P1相比，P30病毒显示出55倍的减少(图3)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．从P1-、P14-和P30感染的细胞中分离出的总RNA的直接RNA测序(DRS)显示，到P30，在连续传代过程中出现的dvg的显著比例保留了横跨Nsp10-Nsp12 (~ 13.3-16.8 kb)的基因组片段(图3)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．从受感染细胞的不同传代中分离出的RNA的Northern blot分析发现，从P20到P30，约5 kb的DVGs保留了Nsp12和ORF10/3'UTR区域(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．由DRS信息构建的转录本模型，保留5 '和3 '端序列(因为这些区域包含重要的复制信号)gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba)，表明在p1感染的细胞中SARS-CoV-2基因组损失了很大一部分(>27 kb)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．到P14时，出现了约4.7 kb的DVG (GI.535)，保留核苷酸13,311/13,312-16,841。到了P30, GI.535和两个相关基因组，GI.1634和GI.1650(仅在5 '端起始位置有差异)在DVG群体中占主导地位(图3)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba及补充资料gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．为了验证GI.535的存在，针对5 '和3 '端(A1和A2)的引物对(补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充资料gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)用于远程(LR) pcr扩增dvg(补充图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)，这些基因被克隆和测序。GI.535端口:(i) Nsp1-10帧内融合，(ii)跨越Nsp11、移码信号和Nsp12的序列，以及(iii) Nsp13和N个ORF的最后116个nts之间的帧外融合(补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们追踪了GI.535中识别的上游和下游连接(USJ和DSJ)的出现，发现这些连接似乎在串行传代过程中共同出现(补充图)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．GI.535是P20-P30中占主导地位的DVG(~83%)，表明该基因组具有稳定的长期繁殖能力(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba， Exp #1)。gydF4y2Ba

为了确定GI.535中识别的结构特征是否可以独立地重新分离，我们在高MOI (Exp #2)下从Exp #1中使用的相同病毒原液中重复了SARS-CoV-2的连续传殖。实验2中P30发现病毒滴度降低了21倍(补充图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．使用一系列探针(a -G)对SARS-CoV-2基因组进行Northern印迹平铺，发现在第14传代出现了约6和7 kb的显著dvg，保留了5 '近端序列(探针a检测到)、横跨Nsp12的区域(探针B)和3 '末端序列(探针G检测到)(补图)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．到P20，我们观察到大约5 kb dvg的出现，并稳定维持了10个额外的传代(补充图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．DRS显示P15的DVG结构池与第一个实验中看到的不同(比较补充图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba， P15到图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba好)。在本实验中，P15处两个最突出的dvg分别是GI.464 (7.2 kb)和GI.384 (5.7 kb)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)，它们的大小与我们在P14中通过Northern blotting检测到的基因组物种相对应(补充图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba，探针B和G，分别用+和*表示)。在实验2的P29中发现的流行dvg在结构上与实验1的P30中发现的dvg相似(比较补充图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(P29)到图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba(e))。P29中数量最多的前7个dvg均含有GI.535中记录的相同的Nsp1-10连接(补充图)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．利用LR-PCR扩增P15和P29的基因组，然后进行Sanger测序，确认了GI.464、GI.384、GI.616和GI.50的结构(补充图)。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba及补充资料gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．Nsp12框架内19个氨基酸缺失存在于GI.616中，并将其与GI.50区别开来(补充图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．LR-PCR显示，大约7 kb基因组出现在P11和P16之间，大约5 kb基因组出现在P20和P30之间。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．我们评估了GI.616和GI.50在P20、P25和P30中的丰度，发现GI.616是P25和P30中存在的主要DVG(25%)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2BaExp #2)。总的来说，这两个实验中相对适合度最高的dvg的结构(i)保留了5 '和3 '端序列，(ii)拥有相同的Nsp1-10结断点，(iii)保留了病毒移码位点Nsp11和Nsp12编码区(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

晚期传代SARS-CoV-2 dvg的复制依赖于辅助病毒gydF4y2Ba

DIs的一个显著特征是它们依赖亲代病毒进行繁殖。为了确定自然选择的dvg是否也是如此，我们以MOI为1或0.0002连续用Exp #2中的P2或P29株感染Vero E6细胞。在第三次感染后，评估感染细胞和培养基的基因组含量(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在MOI为0.0002时，来自P29的dvg更有可能进入未感染的细胞，因此，在随后的传代中应该从种群中丢失。然而，当MOI为1时，DIs更有可能进入病毒感染的细胞，并且在传代过程中应该保持(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．采用RT-qPCR方法分析第三个连续传代(SP3)的细胞和培养基制备的RNA (S/N)。GAPDH转录本仅在细胞RNA制剂中检测到。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．SARS-CoV-2 gRNA存在于P2或P29稀释后的细胞和培养基中。在P29感染的培养基和细胞的RNA中很容易检测到GI.616和GI.50共有的USJ和DSJ (MOI = 1)。相比之下，USJ或DSJ RT-qPCR产物在P29感染细胞的RNA中未检测到(MOI = 0.0002)(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．此外，P2株的感染表明，从SP3细胞裂解液或培养基中分离出的RNA中不存在含有USJ或DSJ的DVGs(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．dvg仅从感染P29 (MOI = 1)的细胞和培养基中恢复(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．在MOI = 0.0002感染细胞的提取物或培养基中未检测到DVGs。因此，突出的dvg只在辅助病毒存在的情况下传播，并且在串行传代后检测到它们也表明它们是打包的。因此，我们将这些dvg称为SARS-CoV-2 DI颗粒。gydF4y2Ba

人工合成的重组DI基因组具有长期稳定性，并能减弱SARS-CoV-2的复制gydF4y2Ba

为了正式证明我们分离的DI基因组负责减弱SARS-CoV-2的复制，我们将GI.50和GI.616对应的序列置于T7 RNA聚合酶启动子的控制下，并添加一个3 ' poly(a)尾巴(图7)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．在体外合成DI rna和RLuc mRNA(阴性对照)。Vero E6细胞感染SARS-CoV-2 8小时后，将RLuc、GI.50和GI.616 RNA转染到细胞中。22小时后，收集病毒并连续传代4次(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．斑块分析显示，感染后接受重组DI RNA的细胞中病毒滴度降低了10 - 20倍，而接受RLuc mRNA的细胞中病毒滴度没有明显降低(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．通过LR-PCR从sp4感染细胞的RNA中恢复了完整的合成DI基因组(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．用α-Nsp1抗体探测细胞裂解液，发现病毒感染细胞中存在Nsp1。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba从GI.616转染细胞中接受病毒的细胞也表达了一种免疫反应蛋白，其分子质量与Nsp1-10融合产物一致(图2-4与1通道比较)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba通过RT-qPCR分析来自P0、SP2和SP4感染的RNA是否存在SARS-CoV-2 gRNA和DI基因组(图2)。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba[原始Ct值]和补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba[数据归一化为GAPDH mRNA水平，并相对于CoV-2 gRNA水平表达])。正如预期的那样，RLuc mRNA在P0转染的细胞中存在，但在SP2-或sp4感染的细胞中不存在。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．所有感染细胞均可检测到SARS-CoV-2 gRNA。USJ和DSJ是DI基因组的独特特征，存在于转染的(P0)细胞以及SP2-和sp4感染的细胞中(图2)。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．GAPDH mRNA和18 S rRNA水平在样品中相似(补充图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．在没有SARS-CoV-2病毒的情况下，GI.50和GI.616基因组在SP2样本中不存在，这与DI复制依赖于亲本病毒一致(补充图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．这些结果表明，合成的重组DI RNA可以在亲本SARS-CoV-2存在的情况下有条件地稳定繁殖，并在感染后削弱病毒复制。gydF4y2Ba

为了评估DIs是否可以作为有条件的基因传递载体，一个emcv驱动gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba将荧光素酶(EMCV/RLuc)或转录调控序列(TRS/RLuc)盒式报告基因插入GI.616的DSJ(图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．用SARS-CoV-2感染Vero E6细胞，进行1 hpi DI RNA转染。接着是四篇连载文章。在接受RLuc转染的SP4病毒的细胞中，仅检测到背景水平的荧光素酶活性(图2)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．相反，转染GI.616-EMCV/RLuc的SP4病毒感染的细胞产生显著的荧光素酶活性(图2)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．然而，GI.616-TRS/RLuc样品的荧光素酶水平最高，比含有GI.616-EMCV/RLuc DIs的细胞高320倍(图2)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．重组GI.616-EMCV/RLuc或GI.616-TRS/RLuc基因组的存在，分别使SARS-CoV-2滴度降低了15倍和30倍。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．我们使用针对TRS-L和renilla ORF的引物，通过RT-PCR证实GI.616-TRS/RLuc产生了包含病毒5 ' TRS-L末端序列的亚基因组mRNA(图2)。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba综上所述，这些结果表明，本文鉴定的DI基因组的合成版本可以用作抑制SARS-CoV-2复制的条件基因传递载体。gydF4y2Ba

重组DI基因组干扰SARS-CoV-2复制gydF4y2Ba

接下来，我们试图查询GI.616限制病毒复制的机制。在感染和转染Vero E6细胞后，病毒连续传代三次，并在SP2和SP3时测定培养基和细胞中的病毒RNA水平(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在p2感染的细胞中，与RLuc对照相比，GI.616降低了SARS-CoV-2 gRNA水平(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．然后比较p2感染细胞中SARS-CoV-2 gRNA相对于SP3培养基中存在的病毒粒子的水平。GI.616的存在并不影响SARS-CoV-2 gRNA从细胞中包装或释放(图2)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．此外，GI.616被包装并以与SARS-CoV-2 gRNA相同的效率释放(图2)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．GI.616的存在不影响SARS-CoV-2 gRNA的传播(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．然而，GI.616基因组的传播速度是SARS-CoV-2 gRNA的四倍(图2)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．综上所述，这些结果表明，在感染早期(4小时)GI.616的强劲复制与感染过程中SARS-CoV-2 gRNA水平的降低有关。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2 DIs编码Nsp1-10融合，抑制病毒复制gydF4y2Ba

SARS-CoV-2 Nsp1是一种多功能蛋白，涉及阻断宿主翻译、细胞mRNA降解和抑制核细胞质mRNA输出gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}．为了确定Nsp1-10是否能在感染细胞中检测到(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，对P2、P15或P30株感染的Vero E6细胞提取物进行Western blot。这些实验结果表明，Nsp1 (~20 kDa)存在于感染细胞中(图2)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba(左侧面板黑色箭头)，而在P15-和p30感染的细胞(红色箭头)中存在一种更大的~30 kDa蛋白，与Nsp1抗体交叉反应。这种蛋白也可以使用针对Nsp10的c端结构域的抗体检测到，该抗体显示了约30 kDa的免疫反应蛋白(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba，右面板红色箭头)。由突出的DIs编码的Nsp1-10融合蛋白在未感染细胞中过表达时主要局限于细胞质(补充图)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Nsp1 c端结构域对于阻断翻译至关重要，因为它与mRNA入口通道相互作用以抑制细胞蛋白质合成gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}．然而，这个结构域在Nsp1-10融合蛋白中是不存在的。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．因此，Nsp1，而不是Nsp1 - 10，通过多体分析评估，抑制细胞翻译(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．与Nsp1不同，Nsp1 - 10不以多体梯度与40s核糖体共迁移(图2)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．这些数据与我们之前所描述的不阻断转译的Nsp1(KH/AA)突变体的观察结果一致(补充图)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba）gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba．Nsp1，但Nsp1 - 10和Nsp1(KH/AA)不受抑制gydF4y2Ba^35gydF4y2BaS-Met/Cys掺入新生多肽链(图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．Nsp1-10无法挽救nsp1介导的细胞翻译抑制(图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)或体外培养(补充图。gydF4y2Ba7 d, egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了评估Nsp1-10区域对DI复制的需求，我们在GI.616中生成了两个缺失突变体ΔNTD-Nsp1和Δ2NTD-Nsp1。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．在与亲本病毒共传代两代后，突变DIs的繁殖受到影响(图2)。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba[原始Ct值]和补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba[数据归一化到GAPDH mRNA水平，并相对于CoV-2 gRNA水平表达])和亲本病毒滴度没有显著影响(图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．在293 T/ACE2细胞中异位表达Nsp1-10可使SARS-CoV-2滴度降低25倍(图2)。gydF4y2Ba5 h,我gydF4y2Ba)．Nsp1-10的作用是选择性的，因为它没有降低登革2型病毒的滴度(补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．虽然我们的数据不能让我们得出关于Nsp1-10在DI复制中的作用的确切结论，但它确实支持这样的结论，即Nsp1-10是一种有效的SARS-CoV-2复制抑制剂。gydF4y2Ba

GI.616编码的Nsp12 (Δ19aa)对聚合酶活性无活性gydF4y2Ba

最后，我们研究了GI.616中Nsp12 (Δ19aa)突变可能对Nsp12活性的影响。根据Nsp12的结构，缺失19个氨基酸有望缩短该蛋白的指区和掌区之间的距离，改变RNA结合(补充图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．使用聚合酶延伸试验，其中使用4-mer引物评估活性，我们监测14-nts产物的外观(补充图)。gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba之前描述的Nsp12 (SNN)活性位点突变体在本试验中不活跃(比较13-18和1车道)gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．同样，Nsp12(Δ19aa)突变体也降低了聚合酶活性(比较19-24车道和1车道)。在含有WT RdRP的反应中，Nsp12(SNN)(2-6车道)或Nsp12(Δ19aa)(8-12车道)的存在不会降低RdRP活性，证明缺乏主导-阴性行为。gydF4y2Ba

目前正在探索将DI颗粒用于几种重要的人类病原体(包括甲型流感病毒)的抗病毒治疗gydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}，寨卡病毒gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba以及基孔肯雅病毒gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．虽然已经从冠状病毒中分离出了几种自然产生的DIs(见导言)，但我们的研究记录了SARS-CoV-2中自然产生的DIs的特征。冠状病毒DIs中存在的一个显著特征是基因组5 '和3 '端序列的保留——这一发现与这些位置的茎环对复制至关重要一致gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba．一个常见的，保守的上游连接元件，融合Nsp1到Nsp10存在于80-90%的晚期传代dvg中。由于在实验#1和#2中使用了相同的病毒种子库，我们不能正式排除在初始种子库中存在含有Nsp1-10的缺陷基因组，尽管在P1中RT-qPCR没有检测到它(补充图2)gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．尽管如此，无论是出现在P0还是在传播过程中产生，它在两个独立的实例(Exp #1和#2)的串行传递中显然是被积极选择的。gydF4y2Ba

Gribble等人。gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba绘制了SARS-CoV-2基因组重组的模式和频率，并报告>50%的重组频率发生在26个位置，其中13个位点映射到TRS位置。值得注意的是，这些位点都没有映射到我们所识别的Nsp1-10连接上。我们无法发现Nsp1和Nsp10之间的主要序列相似性/互补性，这可以很容易地解释Nsp1 - 10融合的出现是不连续转录或重组的结果。驱动这种结融合形成的机制细节有待更好地理解蛋白质- rna相互作用组和在冠状病毒复制期间驱动重组的元素。gydF4y2Ba

虽然Nsp1-10融合出现在干扰素缺乏的Vero细胞中，但其功能并不局限于此，因为Nsp1-10在表达ace2的293 T细胞中的表达减弱了病毒复制(图2)。gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba)．因此，Nsp1-10蛋白似乎代表了一种di编码蛋白，可以减弱辅助病毒的复制。与Nsp1不同的是，Nsp1 - 10不干扰细胞翻译。gydF4y2Ba5 d, egydF4y2Ba)．Nsp1是一种多功能蛋白，也与宿主mRNA的切割和mRNA输出的阻断有关gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}目前的研究旨在评估这些过程是否受到Nsp1-10的影响。gydF4y2Ba

目前已有两篇合成设计SARS-CoV-2 DIs的报道。gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba合成了RNA DIgydF4y2Ba_1克ydF4y2Ba其中，有789个5 '端序列融合到Nsp14 (nt 19,674)， Nsp15融合到3 ' UTR的最后1426个nt。核苷酸19,674-20,340被纳入DI设计gydF4y2Ba_1克ydF4y2Ba因为基因组的这个区域被认为是包装信号的港湾gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．迪gydF4y2Ba_1克ydF4y2Ba在一次病毒传代后能够与SARS-CoV-2共同繁殖gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．多次注射注入gydF4y2Ba_1克ydF4y2Ba没有报道，所以我们不知道这个基因组是否稳定，可以长期繁殖。我们的结果清楚地表明19,674-20,340核苷酸不是包装所必需的，因为我们的主要DIs都没有这个区域。查图维迪等人。gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba报道了第二组合成DIs，他们称之为治疗性干扰粒子1和2 (TIP1和TIP2)。TIP1只包含5 '端(1-450)和3 '端(361个核苷酸)，而TIP2从病毒5 '端(约1.5 kb)融合到3 '端(约713个核苷酸)。TIP1和TIP2在连接断点处都嵌入了EMCV IRES/mCherry。携带TIP1的颗粒可以从被TIP1 RNA核感染并随后被SARS-CoV-2感染的Vero细胞上清液中回收，证明了TIP1在辅助病毒存在下被包装的能力。TIP1和TIP2的合成基因组能够在体内和体外降低病毒滴度gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．这些结果表明Nsp1-10融合并不是DIs降低亲本病毒滴度的特有特征。值得注意的是，在我们的实验中，我们没有通过Northern blotting检测到长度<5 kbp的显著稳定缺陷病毒基因组(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)也不是两个实验后期的纳米孔测序数据中普遍存在的转录模型(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．这些结果表明，在亲代病毒存在的情况下，我们所描述的约5 kb基因组能够稳定地长期繁殖。gydF4y2Ba

目前尚不清楚为什么大多数DI基因组在传代后期保留了横跨Nsp10-Nsp13的序列。由于GI.616编码缺乏聚合酶活性的Nsp12突变体，因此功能性Nsp12蛋白对于DI繁殖不是必需的。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，但在实验#2 P30中DI含量最高(补充图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．是否最近发现了移码位点周围的远程RNA相互作用gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba是平衡翻译和复制事件所必需的，这仍有待研究。gydF4y2Ba

先前的研究表明，有缺陷的干扰粒子可以导致病毒滴度的周期性变化，因为它们不仅与亲本病毒竞争，而且依赖于它们进行繁殖。在DI存在的情况下，亲本病毒水平将下降并达到局部最小值，DI水平随后也会如此，因为它们依赖于亲本病毒进行复制。这反过来又导致亲代病毒水平达到峰值，因为可供竞争的DI颗粒最小。随着传代数的增加，这导致亲代病毒水平和DI水平的周期性变化，其中DI水平的峰值与亲代病毒水平的低谷重叠，反之亦然gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}对野生型脊髓灰质炎病毒与脊髓灰质炎DI基因组共复制之间动力学的深入分析表明，DI基因组复制和包封是影响wt病毒结果的两个最关键参数gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．考虑到控制这些事件用于临床应用的明显复杂性，更可靠的治疗策略可能是将编码DI颗粒的RNA经鼻内递送，事实上，这已被用作在小鼠模型中抑制SARS-CoV-2感染的成功策略gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

我们的研究的一个局限性是，所描述的DIs是从干扰素缺乏的Vero E6细胞中分离出来的，在产生干扰素的细胞系中扩展这些研究将是重要的。我们的结果值得在临床前小鼠模型中进一步扩展和验证，以评估本文披露的合成基因组或Nsp1-10融合蛋白是否能发挥预防或治疗的作用。gydF4y2Ba

产生有缺陷的干扰粒子gydF4y2Ba

Vero E6细胞(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba在6孔板中培养的细胞/孔)在MOI为3的条件下感染SARS-CoV-2 60 min。病毒被清除，用2毫升新鲜的完全DMEM培养基替换。每天监测细胞，在细胞致病效应(CPE)出现24 - 48小时后收集病毒上清。将含有病毒1传代(P1)的上清液的50%用于感染新的一批Vero E6细胞，剩余的P1病毒在−80°C下冷冻成两个等体积的等份。感染1小时后，将病毒去除，用2 ml新鲜的完全DMEM培养基替换。每天监测细胞，CPE出现24 - 48小时后收集上清液。这是病毒的第二代(P2)。重复同样的过程，直到到达第30段(P30)。提取每个传代的总细胞RNA，并在- 80°C保存以备将来使用。实验1和实验2均使用相同的病毒种料。 The Institutional Biosafety Committee of the University of Alberta approved the protocol used in these studies.

斑块化验gydF4y2Ba

Vero E6细胞镀于24孔板(10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba细胞/孔)，37°C孵育过夜。连续稀释含病毒培养基(10gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}-10年gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba})用DMEM介质制成96孔板。在24孔板的Vero E6细胞中各取100 μL，在5% CO中37℃孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1小时，每15分钟摇晃一次。孵育1小时后，除去含病毒的培养基，每孔加入1ml预热的空斑培养基(含2%胎牛血清和0.75%甲基纤维素的MEM培养基)。培养皿在37℃、5% CO中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba3天让斑块形成。第3天，甲基纤维素覆盖物被轻轻去除，细胞通过在每个孔中加入1ml 4%多聚甲醛PBS固定。室温孵育30 min后，取出固定液，用dH冲洗gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO，每孔加1ml 1% (w/v)结晶紫，20%甲醇。30分钟后取出结晶紫溶液，用水清洗盘子。仅在有5-30个斑块的孔中计数。gydF4y2Ba

免疫印迹(Nsp1-10融合)gydF4y2Ba

感染SARS-CoV-2传代P2、P15和P30的Vero E6细胞在感染后24小时收获。细胞用PBS洗涤三次，然后用含有新鲜蛋白酶抑制剂和1单位苯并酶(Millipore;Burlington, MA, USA)。蛋白质在95°C下变性10分钟，SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上进行免疫印迹。使用Odyssey®CLx成像系统(LI-COR Biosciences;林肯，东北，美国)。gydF4y2Ba

Renilla荧光素酶测定gydF4y2Ba

Vero E6细胞(10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba以MOI = 1感染SARS-CoV-2 1 h后，分别用体外合成的RLuc、GI.616-EMC/RLuc和GI.616-TRS/RLuc RNA转染24孔板。在感染后24小时收集上清，澄清，50%的病毒用于Vero E6细胞的连续感染。每传代感染24 h后，取出培养基，PBS洗涤细胞，100 μL renilla luciferase assay lysis buffer (Promega， #E2810)室温裂解15 min。收集裂解液并在- 80°C保存，直到进一步使用。荧光素酶测定，每传代取20 μL加入白色96孔微孔板(Greiner bio-one)，一式两份gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba荧光素酶活性测定。每孔加入100微升renilla荧光素酶测定试剂(Promega， #E2810)，并立即使用Synergy HTX平板阅读器(Biotek;Winooski, VT, USA)。除了在连续感染中使用的病毒上清外，收集剩余的病毒进行滴定。此外，还提取来自每个传代细胞的总细胞RNA，并在−80°C下存储以备将来使用。gydF4y2Ba

RNA转染gydF4y2Ba

Vero E6细胞在DMEM中以2 × 10密度添加10% FBS (Gibco， #12483-020)、1%青霉素-链霉素(Wisent， # 450-200-EL)和1×非必需氨基酸(Wisent， # 321-011-EL)的24孔板中培养gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba细胞/。第二天，介质改为200 uL Opti-MEM (Gibco, 31985070)。用Lipofectamine™3000 (Invitrogen， #L3000015)转染细胞，并按照制造商推荐的方法制备转染混合物。基本上，将500 ng cap-1 mRNA添加到模拟或sars - cov -2感染细胞的每孔中，并在下游处理前孵育22小时。gydF4y2Ba

质粒构建gydF4y2Ba

本研究中使用的所有质粒序列在补充数据中提供gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

有帽mrna的体外合成gydF4y2Ba

携带DI基因组的质粒用BsmBI或Esp3I线性化。用苯酚-氯仿萃取纯化DNA，用HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO，通过1 mL Sephadex™g -50超细珠柱(GE Healthcare， #17-0041-01)，用100%乙醇沉淀，用70%乙醇洗涤，并以1µg/µL的浓度在RNase-free水中重新悬浮。使用线性化质粒作为模板，根据制造商的说明，使用T7 RiboMAX™Express Large Scale RNA生产系统(Promega, P1320)在体外合成mRNA。然后使用牛痘封盖系统(NEB， # M2080S)和mRNA Cap 2′- o -甲基转移酶(NEB， #M0366S)一步反应封盖RNA。RNA清除是通过上文所述的苯酚-氯仿萃取来清除线性化的DNA。浓度由NanoDrop 1000 (Thermo Scientific)定量测量。Cap 1 mRNA与ssRNA阶梯(NEB， # N0362S)一起在1%琼脂糖-甲醛变性凝胶上进行分析，以确认大小和质量。gydF4y2Ba

远程-qPCRs (LR)gydF4y2Ba

为了制备lr - pcr的全长cDNA，根据制造商的说明，使用Superscript™IV逆转录酶(Invitrogen， #18090010)和针对SARS-CoV-2的3 ' UTR的基因特异性引物:(5'CTCCTAAGAAGCTATTAAAATCAC3 ')对总RNA进行逆转录。通过RNase H (NEB， #M0297S)处理获得单链DNA，将得到的cDNA稀释10倍。采用LA-Taq DNA聚合酶热启动版本(TaKaRa， #RR042B)和2µL稀释cDNA作为模板进行lr - pcr。循环条件按照制造商的建议执行。引物在补充数据中说明gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．以LR-PCR产物为模板，生成更小的产物，直接进行Sanger测序。gydF4y2Ba

RT-qPCRsgydF4y2Ba

互补DNA由M-MuLV逆转录酶(NEB, M0253L)或SuperscriptTM IV VILO™Mastermix (ThermoFisher， #11756050)使用随机六聚物引物生成。cDNA被稀释10倍，并使用SsoFast™Evagreen®Supermix (Bio-Rad， #1725201)作为qPCR模板。循环条件包括初始变性95°C/30秒，98°C/5秒，60°C/5秒(40次循环)，65°C到95°C以0.5°C/min的速度递增。用于熔化曲线采集。使用的引物对在补充数据中列出gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

确定病毒传代中dvg的相对丰度gydF4y2Ba

使用Superscript™IV逆转录酶(Invitrogen， #18090010)根据制造商的协议对实验#1和#2中P20、P25和P30的细胞RNA进行逆转录。得到的cDNA用RNase H (NEB， #M0297S)处理并稀释10倍。以稀释后的cDNA为模板，使用A1/A2引物对和LA-Taq DNA聚合酶热启动版本(TaKaRa， #RR042A)进行LR-PCR。主要长程产品经凝胶纯化，并根据制造商说明，使用pGEM®-T Easy Vector System (Promega， # A1360)通过TA克隆到pGEM-T Easy中，或使用EcoRV通过钝器连接到pBluescript II KS(+)中。用碱性裂解法对每个克隆进行微制备，获得质粒DNA，然后进行Sanger测序。gydF4y2Ba

Northern blot分析gydF4y2Ba

对于所有的Northern印迹，总RNA使用NanoDrop 1000 (Thermo Scientific)进行量化。每个样本的RNA在1.2%的甲醛-琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，切除RNA梯道，用SYBR™金核酸凝胶染色(Invitrogen)进行染色。用10× SSC在Hybond N +膜上进行Northern印迹转移。转移后，膜以1.2 × 10进行uv交联gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaµJ /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．用杂交缓冲液(50%甲酰胺、10%硫酸右旋糖酐、0.8 M NaCl、5× Denhardt’s溶液、50 mM Tris 7.5、0.1%热磷酸钠、100µg/mL鲑鱼精子DNA、0.5% SDS)在42℃下预杂交16 h，然后用放射性探针在42℃下杂交16 h。分别用0.1% SDS/2× SSC、0.1% SDS/1× SSC、0.1% SDS/0.5× SSC在65℃下洗涤2次，每次25 min。通过将膜暴露于x射线胶片(BioMax XAR, Kodak)来获得放射自显影。gydF4y2Ba

确定SARS-CoV-2和dip的生长速度、包装效率和传播效率gydF4y2Ba

以MOI = 1感染Vero E6细胞，感染8 h后转染DI mRNA。转染22小时后，所产生的上清连续传代3次，每24小时1次。在P2感染后的指定时间点(4、8和24小时)和P3感染后4小时提取细胞RNA。P2上清24 h提取RNA。RT-qPCR后，用2gydF4y2Ba^{−ΔCtgydF4y2Ba}方法，以GAPDH为对照。结果值归一化到4小时时间点。gydF4y2Ba

为了计算基因组包装百分比和传播效率，采用RT-qPCR方法，根据重组RNA标准建立的标准曲线确定DI和SARS-CoV-2 RNA拷贝数。将DI或WT病毒mRNA打包百分比计算为:100 × (P2上清液mRNA拷贝数)/(P2上清液mRNA拷贝数+ P2细胞mRNA拷贝数)。gydF4y2Ba

透射率计算如下:100 × (P3细胞在4小时时的mRNA拷贝数)/(P2细胞在24小时时的mRNA拷贝数)。gydF4y2Ba

差别洗涤剂分馏gydF4y2Ba

HEK-293T细胞以10的密度在6孔板中播种gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/。在每个孔中，细胞用磷酸钙转染，使用5µg空pcDNA3.1或表达指示蛋白的pcDNA3.1。转染24小时后，在冷PBS中刮取细胞，在4°C下300 ×离心10 min制粒gydF4y2BaggydF4y2Ba．细胞在100µL洋地黄苷提取缓冲液(10 mM PIPES (pH 6.8)， 300 mM蔗糖，100 mM NaCl, 3 mM MgCl中裂解gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 5 mM EDTA, 0.015%洋地黄苷，1 mM PMSF)冰封10分钟，裂解液在4℃下480 ×离心10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba．上清液保留为胞浆部分。将洋地黄苷不溶性颗粒放入相同体积的洋地黄苷提取缓冲液中洗涤一次，以480 ×的速度纺丝gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。废弃上清液后，将颗粒重悬于相同体积的Triton-X-100萃取缓冲液(10 mM PIPES (pH 6.8)， 300 mM蔗糖，100 mM NaCl, 3 mM MgCl中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 5 mM EDTA, 0.5% Triton-X-100, 1 mM PMSF)，冰静置15分钟，5000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。4°C。废弃上清液(膜/细胞器部分)，triton不溶颗粒在100µL的1x样品缓冲液中裂解，得到核部分。在10%的SDS-PAGE凝胶上分离相同的细胞质和核组分，并通过western blotting分析蛋白质。gydF4y2Ba

多核糖体分馏gydF4y2Ba

HEK-293T细胞在10cm培养皿中以5 × 10的速率培养gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba在DMEM中添加10% BGSS、1% Pen-Strep和1% l -谷氨酰胺(Wisent)。第二天，每个质粒用20µg磷酸钙转染细胞。清洗细胞，转染后6-8小时重施新鲜培养基。转染24小时后，在含有100µg/ml环己亚胺的冰冷PBS中收集细胞。细胞在4℃制粒，在425µL低渗裂解缓冲液(5 mM Tris-Cl (pH 7.5)， 2.5 mM MgCl中裂解gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1.5 mM KCl)。将环己酰亚胺(100µg/ml)、DTT (2 mM)、Triton-X-100(0.5%)和脱氧胆酸钠(0.5%)分别加入到指定的最终浓度中，并使样品短暂涡旋。以16000 ×离心清除裂解物gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下加热2分钟。裂解液(400µL)分层到10-50%蔗糖梯度上。梯度在217,000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在SW40贝克曼转子4°C下加热2小时。使用Teledyne ISCO Foxy R1收集器收集馏分，同时监测UV 254剖面。蛋白质用10%三氯乙酸沉淀，16000 × g离心30 min收集。4°C。用500µL丙酮清洗颗粒，4°C离心10 min。16000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba，并在真空下干燥(Eppendorf Vacufuge)。蛋白颗粒重悬于1× SDS样品缓冲液中，并在10% SDS- page凝胶上进行分析。溶解蛋白在4°C转移到PVDF膜(Bio-Rad)上，并通过免疫印迹检测。gydF4y2Ba

抗体gydF4y2Ba

本研究中使用的抗体有:抗nsp1 (GeneTex, GTX135612)、抗nsp10 (Pro-Sci Inc， #9179)、抗flag (Sigma-Aldrich， #F1804)、抗rpl7 (Novus Biologicals， #NB100-2268)、抗gapdh (Abcam， #ab8245)、抗β-actin (Abcam， #ab8226)、抗eef2 (CST， #2332)和抗hnrnpa1 (CST， #8443)。gydF4y2Ba

体外和细胞内蛋白质合成的测定gydF4y2Ba

对于体外翻译，使用SP6 RNA聚合酶(NEB， #M0207S)体外转录FF/EMCV/Ren双子报告子mRNA，并用m共转录封头gydF4y2Ba^7gydF4y2BaGpppG RNA帽类比物(NEB， #S1404S)。用核酸酶处理的兔网织红细胞裂解液(Promega， #L4960)表达20 ng/µL mRNA，并添加相应的重组蛋白。重组蛋白与裂解物在30°C下预孵育5分钟，然后加入mRNA。在30°C下1 h后，将反应置于冰上，加入10µg/mL环己亚胺停止反应。荧光素酶活性在Berthold Lumat LB 9507光度计上测定。gydF4y2Ba

对于[gydF4y2Ba^35gydF4y2BaS]-蛋氨酸/半胱氨酸标记，HEK-293T细胞以10的密度在6孔板中播种gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba在DMEM中添加10% BGSS、1% Pen-Strep和1% l -谷氨酰胺。转染后6-8小时，用指定的pcDNA3.1表达质粒转染细胞，用PBS洗涤三次，胰酶化，并在24孔板中播种，技术重复。转染24小时后，将培养基与不含蛋氨酸、半胱氨酸的DMEM (Gibco， #21013-024)补充10% FBS交换45分钟，然后用22 μ Ci的gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba每孔添加s -蛋氨酸/半胱氨酸蛋白标记混合物(Perkin Elmer， #NEG772007MC)。在37°C/5% CO下标记15分钟gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba细胞在RIPA缓冲液(20 mM Tris-Cl (pH 8.0)， 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS, 0.01 mg/mL抑肽蛋白，0.002 mg/mL leupeptin, 2.5µM pepstatin和1 mM PMSF)中裂解。裂解物被标记在3MM Whatman纸上，蛋白质用10%三氯乙酸(TCA)沉淀。通过闪烁计数对tca不溶性放射性标记的蛋白质进行定量，并将计数归一化至每个样品的DC蛋白测定(Bio-Rad， #5000112)测定的总蛋白质量。裂解物也被SDS-PAGE分解，并转移到PVDF膜(Bio-Rad)时，western blot必须进行。gydF4y2Ba

重组蛋白纯化gydF4y2Ba

重组他的gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba从表达pet15b表达载体的BL21 (DE3)细胞中纯化得到Nsp1、Nsp1 (K164A/H165A)和Nsp1 - 10蛋白。采集单个菌落，培养20 mL过夜。以1 L LB/amp(100µg/mL)接种，IPTG (0.5 mM)诱导培养gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba达到0.8，此时培养物被移至18°C 16 h。离心20分钟，将细胞制成颗粒，再悬浮于20 mL Nsp1超声缓冲液(50 mM HEPES-KOH(pH 7.6)， 500 mM KCl, 5 mM MgCl)中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 40 mM咪唑，10%甘油，1 mM PMSF, 0.01 mg/mL抑肽酶，0.002 mg/mL leupeptin, 2.5 μ M pepstatin, 0.5 mM二硫苏糖醇)，超声裂解(热系统超声;10个脉冲@ 1个脉冲/秒)。裂解物在4°C离心45分钟，48,000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba．蛋白质在Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen， #30210)上纯化，用Nsp1超声缓冲液洗涤两次，用Nsp1洗脱缓冲液(50 mM HEPES-KOH (pH 7.6)， 500 mM KCl, 5 mM MgCl洗脱gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 300 mM咪唑，10%甘油)。洗脱蛋白部分在Nsp1透析缓冲液(40 mM HEPES-KOH (pH 7.6)， 200 mM KCl, 4 mM MgCl)中在4℃下透析过夜gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 10%甘油，1mm二硫苏糖醇)。gydF4y2Ba

RNA纳米孔直接测序gydF4y2Ba

测序前，用“Qubit RNA高灵敏度”定量试剂盒(Q32855;(ThermoFisher Scientific)，其质量在“高灵敏度RNA筛选带”(5067-5579;安捷伦科技公司)。只有高质量的样本被测序。总RNA在MinION流细胞(FLO-MIN106;Oxford Nanopore Technologies)使用“直接RNA测序”文库制备试剂盒(SQK-RNA002;牛津纳米孔技术公司)。我们遵循牛津纳米孔技术公司(简称ONT)提供的SQK-RNA002库制备协议(版本DRS_9080_v2_revM_14Aug2019)，并进行了以下修改。文库制备开始时，实验1的第1、14和30段总RNA为2µg，实验2的第1和29段总RNA为1µg，实验2的第15段总RNA为3µg。gydF4y2Ba

在起始材料为1µg总RNA的情况下，我们使用以下方案。文库制备试剂盒的第一个适配器在15 μ l溶液中与以下成分连接在RNA上:3 μ l NEBNext快速连接反应缓冲液(原液:5×;B6058;NEB)，总RNA 1µg，重组RNA酶抑制剂0.5µl(原液:40单位/µl;2313年;Takara)， 1 μ l RT适配器(RTA;安大略省的);1.5 μ l T4 DNA连接酶(原液:2 M U/mL;M0202;New England Biolabs)，将溶液加到15 μ l无核酸酶水。 This solution was incubated at room temperature for 20 min and subsequently mixed with a 23 µl solution named “reverse transcription master mix” that had the following components: 9 µl of nuclease-free water, 2 µl of 10 mM dNTPs (N0447S; NEB), 8 µl of 5× SSIV RT buffer (18090010; ThermoFisher Scientific), 4 µl of 0.1 M DTT (18090010; ThermoFisher Scientific). Next, 2 µl of SuperScript IV reverse transcriptase (18090010; ThermoFisher Scientific) were added, and the whole reaction was incubated at 50 °C for 2 h and 50 min, then at 70 °C for 10 min, and then the sample was brought to 4 °C before proceeding with a 1.8× volume of “RNAClean XP” beads cleanup (A63978; Beckman Coulter) and one wash of 150 µl with 70% EtOH. The material was then eluted from the beads with 20 µl of nuclease-free water, and the second adaptor was ligated in a 40 µl solution containing the following: 20 µl of reverse-transcribed RNA, 8 µl of NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (stock: 5×; B6058; NEB), 6 µl of RNA Adapter (RMX; ONT), 2.5 µl of nuclease-free water, 0.5 µl of Recombinant RNase Inhibitor (stock: 40 Units/µl; 2313 A; Takara), 3 µl of T4 DNA Ligase (stock: 2 M U/mL; M0202; NEB). The reaction was incubated at room temperature for 20 min followed by 1× volume of “RNAClean XP” beads cleanup (A63978; Beckman Coulter) and two washes of 150 µl with the Wash Buffer (WSB; ONT). The material was eluted, from the beads, in 21 µl of Elution Buffer, and 1 µl of the solution was quantified with the “Qubit 1X dsDNA high sensitivity” kit (Q3323; ThermoFisher Scientific). Approximately 200–250 ngs of RNA/cDNA hybrid were recovered. After priming the MinION flow-cell as per the ONT protocol we loaded the following solution: 20 µl of prepped RNA/cDNA hybrid in Elution Buffer, 17.5 µl of nuclease-free water, 37.5 µl of RRB buffer (ONT). The duration of the sequencing run was up to 72 h or until no pores were available for sequencing.

在起始材料为2或3µg总RNA的情况下，我们使用以下方案。将文库制备试剂盒的第一个适配器连接在含有以下成分的30 μ l溶液中的RNA上:6 μ l NEBNext快速连接反应缓冲液(原液:5×;B6058;NEB)， 2或3µg总RNA, 1µl重组RNA酶抑制剂(原液:40单位/µl;2313年;Takara)， 1 μ l RT适配器(RTA;安大略省的);3 μ l T4 DNA连接酶(原液:2 M U/mL;M0202 NEB)，加无核酸酶水至30 μ l。溶液在室温下孵育20分钟，随后与46 μ l名为“逆转录主混合物”的溶液混合，其中含有以下成分:18 μ l无核酸酶水，4 μ l 10 mM dNTPs (N0447S; New England Biolabs), 16 µl of 5× SSIV RT buffer (18090010; ThermoFisher Scientific), 8 µ of 0.1 M DTT (18090010; ThermoFisher Scientific). Next, 4 µl of SuperScript IV reverse transcriptase (18090010; ThermoFisher Scientific) were added, and the whole reaction was incubated at 50 °C for 2 h and 50 min, then at 70 °C for 10 min, and the sample was brought to 4 °C before proceeding with a 1.8× volume of “RNAClean XP” beads cleanup (A63978; Beckman Coulter) and one wash of 300 µl with 70% EtOH. The material was then eluted from the beads with 40 µl of nuclease-free water, and the second adaptor was ligated in a 80 µl solution containing the following: 40 µl of reverse-transcribed RNA, 16 µl of NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (stock: 5×; B6058; New England Biolabs), 6 µl of RNA Adapter (RMX; ONT), 11 µl of nuclease-free water, 1 µl of Recombinant RNase Inhibitor (stock: 40 Units/µl; 2313 A; Takara), 6 µl of T4 DNA Ligase (stock: 2 M U/mL; M0202; New England Biolabs). The reaction was incubated at room temperature for 20 min followed by 1× volume of “RNAClean XP” beads cleanup (A63978; Beckman Coulter) and two washes of 150 µl with the Wash Buffer (WSB; ONT). The material was eluted, from the beads, in 38.5 µl of Elution Buffer, and 1 µl of the solution was quantified with the “Qubit 1X dsDNA high sensitivity” kit (Q33230; ThermoFisher Scientific). Approximately 400–750 ngs of RNA/cDNA hybrid were recovered. After priming the MinION flow-cell as per the ONT protocol we loaded the following solution: 37.5 µl of prepped RNA/cDNA hybrid in Elution Buffer, 37.5 µl of RRB buffer (ONT). The duration of the sequencing run was up to 72 h or until no pores were available for sequencing.

纳米孔数据分析管道和分析文件gydF4y2Ba

我们的纳米孔分析管道的详细描述在补充说明中提出gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．作为补充数据，提供了直接RNA纳米孔运行的汇总统计表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，并附在“补充说明”内的说明部分gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和补充图中的附图。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．来自纳米孔分析管道的中间和最终文件作为补充数据提供gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba.zip格式，并在补充说明中列出每个文件的说明gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

统计和再现性gydF4y2Ba

使用GraphPad Prism软件(版本6.01;GraphPad软件公司，La Jolla, CA, USA)。结果以均数±标准差表示。平均比较使用双尾学生进行gydF4y2Bat -gydF4y2Ba检验或方差分析。为每个实验进行的生物独立重复的数量在图例中显示。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba