东方大黄蜂蜂群中花蜜营养物质的持续交换

哺育后代是通向社会性的第一步进化¹．在复杂的动物社会中，如虎鲸、吸血蝙蝠和灵长类动物，同一群体的成年个体之间也会发生相互喂食的情况^2，3.，4．在群居昆虫中，由于食物通常只由少数个体(觅食者)收集，然后在群体的所有成员中传播，所以觅食达到了更复杂的水平⁵．这种群居喂养把所有的群体成员团结在一起⁶．

群居昆虫成虫之间的营养交换是双向的，即它们既可以是同一种食物或营养的供者，也可以是受者^7，8．相反，对于幼虫来说，这种交换通常是单向的，因为幼虫是无梗的，必须从成虫那里获得食物⁶．然而，在一些膜翅目昆虫中，幼虫会向成虫分泌一种液体，以促进成虫对食物的加工^9，10．在火蚁中火红蚁还有切叶蚁Acromyrmex subterraneus，幼虫的消化酶谱比成虫更高、更多样化^11，12．有人认为，这些幼虫的分泌物含有消化酶，促进食物加工的成人食用^9，11，13．在群居黄蜂中，幼虫的分泌物是成虫的主要食物来源之一^{7，14，15，16}．黄蜂幼虫以成虫收集的猎物(节肢动物或腐肉)为食，作为交换，幼虫将蛋白质降解产物作为含有简单碳水化合物和游离氨基酸(分别来自糖异生和蛋白质分解)的分泌物送回成虫。^14，17．尽管工蜂可以部分消化从猎物身上获得的蛋白质，雄性却不能，完全依靠幼虫来消化蛋白质¹⁰．这种相互和单方面的营养交换(即蛋白质对碳水化合物和游离氨基酸)，以及成虫和幼虫之间的营养相互依赖，被认为是建立Vespidae社会性的关键^10，15．

尽管群居黄蜂是凶猛的昆虫猎手，成年黄蜂也经常被观察到以各种不同植物的花蜜为食¹⁸．亚洲大黄蜂(绒毛状黑胸例如，被观察到以27种植物的花蜜为食¹⁹．然而，这种花蜜的消耗通常被简单地描述为一种投机取巧的行为，因为赏花也可以与捕食猎物联系在一起¹⁹．成年工人是强壮的飞行员，新陈代谢率极高^20.以花蜜和幼虫分泌物中的高碳水化合物和游离氨基酸为其新陈代谢提供能量^15，21．这种富含碳水化合物的饮食也可能保护它们的飞行肌肉免受来自高有氧表现的氧化应激²²．幼虫分泌物的大量营养素组成类似于植物的花蜜，虽然它的氨基酸浓度和多样性通常更丰富²³．与工蜂相比，幼虫需要富含氨基酸的食物，以合成发育所必需的蛋白质，它们以高蛋白质的饮食维持。既然幼虫以猎物为食，幼虫的分泌物对成虫来说比花蜜更有营养，为什么这些黄蜂也以花蜜为食呢?亨特等人报告说Polybia occidentalis接受了一些成虫收集的花蜜，因此花蜜对幼虫来说可能是一种额外的资源²⁴．然而，花蜜在黄蜂营养中的作用在很大程度上仍然是未知的。

群居昆虫收集到的花蜜通常储存在作物中，并通过被称为营养性的口对口交换转移到其他个体⁹．营养性是一种在所有群体成员间快速转移营养物质的有效机制^{24，25，26，27}．到目前为止，食用染料^28，29有放射性标签的食品^{24，26，30.，31，32，33}以及最近的荧光染色食品^34，35，已被用于研究膜翅目昆虫通过营养轴的资源转移路径。虽然这些方法为蜂群内部的食物交换动态提供了有价值的信息，但它们受到了标记整个食物资源的限制。相比之下，使用稳定的同位素标记宏量营养素可以研究存在于食物资源中的特定营养素，甚至特定碳是如何被每个群体成员转移、分配和利用的^10，36．

在这项研究中，我们使用了富含a的人工花蜜¹³C₁重要生酮氨基酸(亮氨酸)，以研究花蜜中的一种特定的宏量营养素是如何在群居的东方大黄蜂的群体中被利用和交换的(胡蜂属胶)．我们还研究了花蜜对蜂群生存的重要性。我们的研究结果揭示了花蜜在大黄蜂营养中的重要作用。我们的研究表明，花蜜营养物质在蜂群成员的所有不同生命阶段之间以连续的循环进行交换，挑战了这一领域迄今为止的主流知识。

实验一:花蜜中大量营养素的转移和分配到身体组织

6个实验蜂群(含10个幼虫和3个工蜂)饲喂添加了标记亮氨酸的人工花蜜7天(6个对照实验蜂群饲喂未标记的人工花蜜)。

亮氨酸标记的碳被同化到成年大黄蜂的身体组织和卵中，卵中同化程度更高(图1)。1；治疗:F_1、27.300= 330.485,P< 0.0001;身体组织:F_3、27.638= 9.818,P= 0.0001;治疗×身体组织:F_3、27.638= 7.284,P= 0.0009)。然而，工蜂也用花蜜喂养幼虫。标记亮氨酸在幼虫、蛹和蚕丝的身体组织中发现，但在胎粪中没有发现。2、处理:F_1、67.431= 129.075,P< 0.0001;身体组织:F_3、92.093= 36.990,P< 0.0001;治疗×身体组织:F_3、94.961= 16.737,P< 0.0001)。

实验二:花蜜和猎物常量营养素在幼虫分泌物中的分配

两个实验蜂群包含100个幼虫和30个工蜂，分别喂食含有标记亮氨酸和未标记猎物(大黄蜂)的人工花蜜，未标记人工花蜜和蛋白质标记的猎物(标记亮氨酸)，或未标记人工花蜜和未标记猎物(对照)。

来自人工花蜜和猎物的亮氨酸标记碳在幼虫分泌物中被发现(图。3.,χ²= 17.273, df = 2，P= 0.0001)。这种标记的大量营养素也在幼虫的身体组织(F_2、14= 18.575,P= 0.0001, Dunnett多重比较:对照与花蜜亮氨酸，z= 6.092,P< 0.0001，对照vs猎物亮氨酸，z = 3.210，P= 0.002)，在大多数成年人的组织(大脑:F_2、2= 28.844,P< 0.033, Dunnett多重比较:对照与花蜜亮氨酸，z = 7.347，P< 0.0001，对照vs猎物亮氨酸，z = 2.004，P= 0.082;肥胖身材:F_2、2= 2264.500,P= 0.0004, Dunnett多重比较:对照与花蜜亮氨酸，z= 63.17,P< 0.0001，对照vs猎物亮氨酸，z= 11.480,P< 0.0001;肌肉:F_2、3= 149.47,P= 0.0009, Dunnett多重比较:对照与花蜜亮氨酸，z= 15.433,P< 0.0001，对照vs猎物亮氨酸，z= 0.967,P= 0.524)，证实了幼虫和成虫都吃花蜜和猎物。

实验三:花蜜对成活率的影响

30个实验蜂群，包含10个幼虫和3个工蜂，分别用一种只有花蜜的饮食(未标记的人工花蜜)、一种有花蜜和猎物的饮食(未标记的人工花蜜和未标记的大黄蜂)或一种只吃猎物的饮食(未标记的大黄蜂)喂养了一周。

成年大黄蜂在没有花蜜的情况下无法生存。4F_2、27.758= 13.879,P< 0.0001)。幼虫死亡率在没有花蜜的情况下也显著增加。4 BF_2、39.471= 19.735,P< 0.0001)。

“社会性黄蜂营养理论”认为成虫和幼虫之间存在营养上的相互依赖关系，成虫只给幼虫提供蛋白质，幼虫则向成虫提供碳水化合物和游离氨基酸¹⁵．在这里，我们反驳了这一理论，并证明同一种营养物质可以在不同生命阶段之间使用和交换，这是一个连续的循环:从成虫到幼虫再回来。我们发现一种来自花蜜的大量营养素，即必需氨基酸亮氨酸，被分配到成虫和幼虫的组织中，并通过营养轴来回交换。我们还发现花蜜对蜂群的生存至关重要:没有这种额外的营养来源，成虫和幼虫都无法生存。结果表明:(1)成蜂在营养上不依赖幼虫，可直接从花蜜中获取氨基酸;(2)猎物并不是幼虫的唯一食物来源，幼虫也可以从花蜜中获取氨基酸等简单的营养物质。

此前发现，工蜂利用花蜜衍生的营养物质来促进新陈代谢^21，37．在这里，我们展示了花蜜来源的亮氨酸被纳入所有被检查的成虫身体组织(大脑、脂肪体和肌肉)以及工蜂下的蛋(在没有蜂王的情况下，工蜂发育卵巢并产下未受精卵)³⁸)．我们的研究结果证实了在类人猿中，如东方大黄蜂，来自花蜜的营养物质用于繁殖和躯体需求，正如先前在鳞翅目动物中所证实的那样³⁹．然而，不像非群居昆虫，而类似于蜜蜂⁴⁰在美国，工蜂也会用一部分花蜜来滋养幼虫。幼虫利用这些花蜜来源的营养物质进行发育和产丝，因为标记的亮氨酸被发现在幼虫和蛹的体组织和蛹的丝帽中被同化。我们在化蛹幼虫的胎粪中没有发现标记亮氨酸的痕迹，这表明在幼虫发育过程中没有营养物质被闲置。因此，我们的发现证实了Hunt等人的发现，表明幼虫也可以用采蜜者收集的花蜜喂养²⁴．令人惊讶的是，我们发现幼虫将之前从工蜂那里得到的一些营养物质转移回工蜂体内。这些发现表明幼虫分泌物中的营养物质并非完全来源于糖异生和蛋白质分解，反驳了之前的观点^14，17．然而，还需要进一步的实验来定量评估幼虫分泌物成分中每种食物(猎物和花蜜)的来源。我们的研究结果支持了一种营养理论，即成虫和幼虫之间的相互取食是黄蜂社会性进化的重要驱动力¹⁵．然而，我们认为，在所有群体成员之间持续循环的营养交换，而不是特定营养的单方面交换(例如，蛋白质对游离氨基酸和碳水化合物)，是更可能涉及社会凝聚力的机制。

虽然大家都知道群居黄蜂会消耗花蜜，但它们在生态系统中传粉者的角色却常常被忽视¹⁸回顾一下)。在科学文献中，关于幼虫对蛋白质的营养需求的报道完全盖过了对额外营养需求的讨论¹⁵．在这里，我们已经证明，无论是幼虫的分泌物，还是猎物，都不足以分别维持成虫和幼虫的营养需求，没有额外的碳水化合物来源的供应，工蜂和幼虫的死亡率都急剧增加。因此，对群居黄蜂来说，采花并不是兼性的;与蜜蜂类似，黄蜂也应该被视为重要的传粉者。例如，蜜蜂幼虫需要14.58%到26.30%的碳水化合物才能正常发育⁴¹．因此，大黄蜂幼虫在饮食中需要额外的碳水化合物来源，如花蜜，这并不奇怪。群居的蜘蛛科的成虫也经常被观察到吃掉成熟的水果¹⁵尽管它们是否用果实喂养幼虫还有待研究。令人惊讶的是，同时含有花蜜和猎物的食物比只含有花蜜的食物导致了更高的幼虫死亡率。这可能是由于在我们的实验中，人工花蜜中的氨基酸和蔗糖浓度是固定的，大黄蜂无法平衡它们的营养摄入。饲料中高浓度的氨基酸是有毒的，会导致许多群居昆虫的高死亡率^{42，43，44，45}．然而，需要注意的是，花蜜中的氨基酸含量远低于昆虫猎物的氨基酸含量^46，47．因此，尽管在我们为期7天的实验中，只吃花蜜的饮食没有影响幼虫的生存，但在没有猎物供应的情况下，幼虫不太可能完全发育。

花蜜的成分和浓度在种内和种间差异很大⁴⁸．我们研究中使用的人工花蜜，由50%的蔗糖溶液和10种必需氨基酸的混合物组成，可能与东方大黄蜂自然采集的花蜜不同。为了更好地了解花蜜在黄蜂营养中的作用，有必要进一步研究东方大黄蜂在自然条件下摄取和采集的植物种类和花蜜的组成。

使用一个¹³C标记的营养物质，我们揭示了在社会性昆虫中通过营养性发生的营养循环。其他群居昆虫和哺乳动物也发生营养性^{2，9，49，50，51}．因此，研究一个社会群体中个别营养物质的利用和交换，将使我们对营养物质相互作用在形成社会性方面的作用有更深的理解。

昆虫的收集及保养

东方大黄蜂(胡蜂属胶)是一种大型的群居黄蜂，主要分布在东南欧、北非和西亚，目前正在全球范围内蔓延⁵²．这个物种每年在地下洞穴中建立殖民地，由多达几千个个体组成⁵³．

从特拉维夫大学附近地区收集的六个东方大黄蜂群体被用来创建我们的实验群体(2到15个，取决于实验)。包含卵、幼虫和蛹的蜂冠被从地下挖出来，成年工蜂被用一张网从挖出来的蜂群中收集。实验蚁群在挖掘后的一个小时内就建立起来了。实验在气候控制的房间(25±2°C, 75±10% RH)中进行。我们用大黄蜂(Bombus terrestris)，是大黄蜂常见的蛋白质来源^10，54，喂养实验菌落，根据我们的实验设计。大黄蜂蜂群购买自AgroBee, Ein Yahav, Israel。

实验一:花蜜中大量营养素的转移和分配到身体组织

为了研究单一花蜜宏量营养素在不同生命阶段个体体内的传递和分配情况，我们将含有10个1 ~ 5龄幼虫的蜂冠制成实验蜂群，并将蜂冠粘在10 × 14.4 × 12 cm的木箱上，每个木箱配有3只工蜂。

每个实验菌落都免费提供一个含有50%蔗糖溶液的试管和一根额外的水管。每隔一天提供两只成年大黄蜂的尸体作为蛋白质来源。

蔗糖溶液用1mm的¹³C₁-标记亮氨酸(Cambridge同位素实验室，Tewksbury, MA, USA)，而对照组只提供蔗糖溶液。每组设6个重复(即试验菌落)。

7天后冷冻牺牲实验菌落，解剖出不同组织，用蒸馏水彻底清洗，60°C干燥3天。采集成年大黄蜂的大脑、脂肪和肌肉组织，以及幼虫的身体组织进行分析。在7天的处理过程中，部分成年大黄蜂产卵，部分幼虫化蛹。因此，还收集和分析了卵和蛹的身体组织、丝和胎粪(即化蛹前排出的幼虫粪便)。

实验二:花蜜和猎物大量营养物质在幼虫分泌物中的分配

在这个实验中，我们调查了幼虫分泌物中营养物质的来源(花蜜和/或猎物)。为了收集足够的分泌物用于同位素分析，我们使用了更大的实验菌落:装有大约100个幼虫的梳子碎片被放置在大木箱(14立方升)中，连同它们各自的30个工蜂。每个实验菌落都免费提供一个含有50%蔗糖溶液的试管和一根额外的水管。每隔一天提供10只成年大黄蜂的尸体作为蛋白质来源。实验中使用了三种不同的饲料。第一组给予含1 mM的蔗糖溶液¹³C₁-亮氨酸和未标记的大黄蜂。第二组饲喂未标记的蔗糖溶液和蛋白标记的大黄蜂¹³C₁-亮氨酸富集蔗糖溶液(100 mg¹³C₁-亮氨酸每25毫升50%蔗糖溶液)冷藏7天，冷冻杀死(见参考文献。10)．对照组提供未标记的蔗糖溶液和未标记的大黄蜂。

7天后，成年大黄蜂被乙醚麻醉并从盒子中取出。然后用毛细管移液管轻轻刺激幼虫的下颌区收集幼虫的分泌物。为了验证标记的营养物质已被完全摄取并吸收到大黄蜂体内，每个重复对两个工蜂(大脑、脂肪体和肌肉)和三个幼虫的组织进行δ分析¹³C的水平。幼虫分泌物和组织样本在60°C下干燥三天后进行分析。

每组进行2个重复(即实验菌点)，每个重复分析3 ~ 5个幼虫分泌物样本。

实验三:花蜜对成活率的影响

为了评估花蜜在大黄蜂营养中的重要性，我们将含有10个1 ~ 5龄幼虫的梳子粘在木箱(10 × 14.4 × 12 cm)的天花板上，每个木箱有3个工蜂。每个实验菌落被随意提供一管水。实验中使用了三种不同的饲料。第一组(纯花蜜饲粮)自由提供由50%蔗糖溶液混合以下10种基本氨基酸组成的人工花蜜，其浓度为等摩尔浓度(1 mM):蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和组氨酸(Sigma-Aldrich, Israel)。第二组(只捕食)只提供成年大黄蜂的尸体(每两天两只大黄蜂)。第三组(花蜜和猎物饲粮)提供人工花蜜(用于纯花蜜饲粮组)和成年大黄蜂的尸体(用于纯猎物饲粮组)。每天清点成年工人的尸体，然后从箱子里移走。7天后，用乙醚麻醉成年大黄蜂并将其从盒子中取出，统计蜂房中活幼虫的数量。为了避免幼虫的死亡率与成虫的死亡率产生偏差，死亡的成虫立即被各自群体的新成虫取代。每组10个重复(即实验菌落)。

稳定同位素分析

每种干组织(幼虫体组织、蛹体组织、蚕丝、胎粪、成虫脑组织、成虫脂肪体组织、成虫肌肉组织、卵和幼虫分泌物)各取1 mg样品装入锡胶囊。对于鸡蛋分析，为了达到1毫克的最小干质量，我们从每个复制中收集了几个(5到11个)鸡蛋。的δ¹³用Picarro G2121-i腔衰荡谱δ测量和计算样品中的C(‰)值¹³C稳定同位素分析仪，使用A0502环境CO₂A0201燃烧模块、A0301气体接口(CM-CRDS)²¹．为了确认分析仪的校准结果，我们运行了验证δ的二级标准¹³C值(蔗糖)每10个样品。所有¹³C浓度以δ表示¹³C_VPDB．

统计和再现性

为了研究标记亮氨酸在工蜂和幼虫不同身体组织中的分配(实验1)，我们采用广义线性混合模型，然后进行事后配对比较(Tukey调整)，比较δ¹³不同处理之间的C浓度。模型包括处理、所分析的身体组织类型以及它们之间的相互作用作为固定因素，重复被嵌套在起源菌落中作为随机因素。的δ¹³C值为log₁₀-变换(x最小值+1)拟合正态分布。

为了研究花蜜和猎物的标记亮氨酸在幼虫分泌物中的分配情况(实验2)，由于数据在转换后仍不服从正态分布，我们使用Kruskal-Wallis秩和检验，然后对未转换的数据与对照进行Dunnett’s多重比较。利用广义线性混合模型分析两种不同标记亮氨酸在工蜂和幼虫各身体组织中的分配情况，然后对各组织与对照进行Dunnett多重比较。重复嵌套在起源菌落中作为一个随机因子，δ¹³C值为log₁₀-变换(x最小值+1)拟合正态分布。

为了评估花蜜对蜂群生存的作用(实验3)，采用具有泊松分布的广义线性混合模型，随后进行事后两两比较(Tukey调整)，以起源蜂群为随机因素，分别比较处理之间死亡工蜂和幼虫的数量。

运行统计测试，并在r4.0.3上生成图形⁵⁵．统计p-value被认为是显著的小于0.05。

报告总结

关于研究设计的进一步信息可在自然研究报告摘要链接到本文。