摘要
1,3a,6a-三氮戊二烯(TAP)是一种紧凑的荧光发色团,其荧光性质因TAP环上取代基的不同而有很大变化。本研究研究了各种TAP衍生物的光诱导细胞毒性。在导数中,2-p-硝基苯基- tap在紫外线照射下对HeLa细胞有明显的细胞毒性,而在没有紫外线照射的情况下没有细胞毒性。此外,光诱导细胞毒性2-p-硝基苯基- tap被发现对癌细胞有选择性,对HeLa细胞和HCT 116细胞有效。在紫外线照射下,2-p-硝基苯- tap产生活性氧(ROS),诱导癌细胞凋亡和铁下垂。因此,揭示了2-p-硝基苯- tap是光照射产生ROS的最致密的染料。
简介
化疗是目前最常见的癌症治疗方法,但由于化疗对肿瘤的选择性较低,毒副作用问题十分严重。为了减少副作用,对肿瘤组织中特定刺激表现出细胞毒性的刺激反应性前药进行了深入研究1,2,3.,4.有机染料在光照射下产生活性氧(ROS)并引起细胞损伤,由于其高效杀伤癌细胞的能力以及在光动力治疗(PDT)中的应用,作为一种有前途的刺激反应前药受到了广泛的关注。5,6,7,8,9.到目前为止,大多数作为ROS发生器开发的染料都是基于现有荧光分子的分子结构,如卟啉、酞菁、氯化物和荧光素5,6,7,8,9.为了扩大光活性前药和PDT的可能性,一直需要开发结构新颖的光活性染料10,11.特别是,小分子尺寸的染料有望在体内有效循环,也有望不影响母分子的原始行为,当偶联到目标亲和分子,如抗体,糖链,多肽和蛋白质。到目前为止,方青烯已被报道为用于PDT的小型染料的例子,但仍有一些有待改进的地方,如弱细胞毒性12.2011年,我们发现了1,3a,6a-三氮戊二烯骨架(TAP) (1)是一个紧密的和高荧光的发色团(图。1)13.在揭示了TAP的荧光性质后,我们合成了具有不同取代基的TAP类似物14,15,16,17并将TAP扩展到各种荧光功能分子,如荧光机械致变色化合物18,荧光细胞染色试剂19,荧光生物活性官能团20.和铁离子传感器21.其他小组报道了具有不同取代基模式的TAPs替代方法及其在荧光生物成像中的应用22,23,24,25,26,27,28.最近,我们开发了一种TAP类似物TAP- vk1,作为一种最紧凑的荧光标记试剂,并成功地可视化了小型降压试剂卡托普利在血管内皮细胞中的分布,证明了TAP环的偶联不影响母分子的原始生物活性,尽管其分子尺寸非常小,如卡托普利(MW: 217)(图)。1 b)29.因此,我们认为如果TAP类似物可以通过光照射产生ROS,那么它将是一种很好的光反应前药,可以与分子靶向试剂偶联。在我们之前对TAP的研究中,我们发现它的性质,如荧光强度、荧光波长、化学反应性、光稳定性和细胞毒性,根据TAP环上取代基的不同而有很大的变化。因此,考虑到一些TAP衍生物可能具有光诱导细胞毒性,我们利用目前合成的几种TAP衍生物研究了它们的光活性。
在此,我们报道了一种基于TAP的非常规光诱导细胞毒小型荧光染料的成功开发。TAP衍生物强大的光诱导细胞毒性源于高效的ROS生成,细胞死亡机制被揭示为低浓度下的铁下垂和高浓度下的细胞凋亡。本研究研制了一种能在紫外线照射下开启上铁症的非常规上铁诱导剂。
结果
第一次筛选
利用HeLa细胞进行了TAP衍生物光诱导细胞毒性的首次筛选。在TAP衍生物的各种取代基模式中,2-取代TAP衍生物根据其可用性和先前报道选择1-米进行检查(图;2)(补充表格1).由于TAP 2位的吸电子基团增加了化学稳定性和荧光强度,目前合成的TAP衍生物大多具有吸电子基团。为了更广泛地研究光诱导的细胞毒性,还新合成了几种具有电子捐赠基团的TAP衍生物,并对其进行了评估(1 n-p)(图。2).首先,25 μM和100 μM溶液的TAP衍生物1-p在37℃的培养液中(100 μL DMEM 10% FBS)用HeLa细胞处理。混合物在37°C下孵育1小时,然后用紫外线(UV) (365 nm, 6 W)从5厘米的距离照射细胞1小时(补充图)。1).在没有紫外线照射的情况下,TAP衍生物在25 μM和100 μM溶液中均无细胞毒性1的烷基链1TAP环基本上是一种无细胞毒性的发色团(图2)。2 b).相反,在紫外线照射下,细胞状态根据添加的TAP衍生物而显著变化。几种衍生物未表现出明显的细胞毒性,而其他一些衍生物可诱导细胞死亡;p-nitrophenyl模拟1 d以浓度依赖的方式显示出特别有效的效果(图。2摄氏度).另一方面,在相同条件下(365 nm, 6 W, 5 cm距离,1 h),没有TAP类似物,仅紫外线照射不会导致明显的细胞死亡(补充图。2).强烈的紫外线照射条件通常会损伤细胞,但本研究的条件没有显示出明显的细胞毒性,可能是由于照射条件较弱。此外,蓝光LED照射还引起了浓度依赖性的光致细胞毒性1 d,虽然弱于紫外线(补充图。3.).
Nitrophenyl-TAP类似物
鉴于光诱导细胞毒性作用的发现p-nitrophenyl模拟1 d,我们也合成了o硝基(1问),米硝基(1 r),o,p-二硝基苯类似物(1)从相应的炔烃中以类似的方式合成1 d评价硝基在不同位置的取代基效应。正如我们预期的那样,没有一种衍生物在没有光照射的情况下表现出细胞毒性(图。3).另一方面,紫外线照射对所有衍生物的细胞毒性均呈浓度依赖性,尽管其光活性强度随硝基位置的不同而不同。在硝基类似物中p硝基模拟1 d显示出迄今为止最强的光诱导细胞毒性,具有IC50值为3.6 μM米硝基模拟1 r和o,p地乐酚模拟1没有预期的那么强大。此外,活动o硝基模拟1问相当虚弱。因此,p硝基模拟1 d被认为是迄今为止最有希望的方法(图。3 b, c).
癌细胞系
其次,有效性1 d对其他癌细胞进行了研究。有趣的是,光诱导的细胞毒性1 d根据癌细胞类型的不同,差异很大。而1 d紫外线照射强烈诱导HeLa(宫颈癌)和HCT116(结直肠癌)细胞死亡,RPMI8226(骨髓瘤)、CCF-STTG1(脑癌)和A549(肺癌)细胞有弱细胞毒活性,对GIST-T1(胃肠道间质瘤)细胞无损伤(表2)1).因此,光诱导的细胞毒性1 d被发现对某些癌细胞系有选择性,对哪些癌细胞系有选择性1 d发现可有效应用于内窥镜光疗。
利用吸收
的潜力1 d作为一种非传统的PDT染料,我们接下来研究了其细胞毒性的机制。首先,明确交互作用1 dHeLa细胞孵育1 h后,更换培养基,然后进行紫外线照射。1 d再次证明了光诱导的细胞毒性,尽管与不更换培养基的情况相比,活性略有降低(补充图。4).因此,1 d被细胞吸收或与细胞表面相互作用。处理后不经孵育的紫外线照射也能观察到类似的活性1 d的相互作用或结合1 d(补充图;4).然后,我们观察处理后的荧光1 d为了弄清楚它是否被细胞吸收。应用各种浓度后1 d溶液孵育1 h后,清洗细胞,用共聚焦激光显微镜观察。在555 nm激发时观察到细胞内荧光,荧光强度与浓度有关1 d,这表明1 d被纳入细胞(图;4、补充图。5用于放大细胞成像)。有趣的是,自1 d在555 nm附近没有吸收带,是否认为1 d在细胞内转化为其他物质。确实,在不洗涤的情况下直接用荧光显微镜观察培养基时,即使有足够量的未反应培养基,也没有从培养基中观察到荧光1 d在场;只有细胞发出荧光(补充图。6).细胞内硝基的还原1 d以亚硝基还原酶还原氨基被认为是可能的,但合成p-aminophenyl丝锥1阿并对其荧光性质和光致细胞毒性进行了评价1阿不是活跃物种(图;2而且补充的方法).我们不知道是什么1 d到目前为止在细胞中转化成,但我们计划在未来阐明代谢物的结构。的本土化1 d还通过与细胞器标记器共染色进行了研究。荧光1 d在细胞中观察到一个点形状。荧光定位1 d主要与核内体标记Rab7重叠,也与溶酶体等其他细胞器略有匹配(见补充图)。7).通过计算Pearson系数对局部化程度的量化也表明1 d主要分布于晚期核内体,在大多数参与囊泡转运的细胞器(早期核内体、溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体、过氧化物酶体)中略有分布(补充表)2).
细胞内荧光和细胞毒性
通过观察HeLa细胞内的荧光,我们研究了荧光强度和光诱导细胞毒性之间的关系。从HeLa细胞中观察到最强的荧光,HCT116细胞也比其他细胞发出更强的荧光。这些细胞的死亡是由光照射引起的。另一方面,除了CCF-STTG1外,表现出弱光诱导细胞毒性的细胞没有表现出强荧光。这表明,光诱导的细胞毒性1 d根据进入细胞的量或细胞中转化为激活形式的量而增强(图2)。5 a、b、补充图。8用于放大细胞成像)。
ROS生成
接下来,研究了细胞死亡的机制。而紫外光诱导的细胞死亡呈浓度依赖性1 d,在…面前N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为自由基清除剂,即使在紫外线照射下,无论浓度如何,细胞毒性都被取消(图2)。6 a、b).这一结果提示了活性氧(ROS)作为细胞毒性活性物种的可能性1 d活性氧被自由基清除剂猝灭。因此,我们使用了基于ROS检测细胞的检测试剂盒30..在没有紫外线照射的情况下,50 μM处理对ROS检测试剂盒的荧光没有增强作用1 d,荧光强度与未处理相似。500 μM H处理2O2阳性对照显著增加荧光检测试剂盒(P= 0.00429 vs未经治疗的学生t-test), 3 mM NAC的存在抑制了荧光增强(图。6摄氏度).另一方面,在紫外线照射下,即使在未经处理的细胞中,荧光也增加,这表明ROS的产生。50 μM处理1 d显著增加荧光强度与H相似2O2(P= 0.00551 vs未经治疗的学生t-test),添加3 mM NAC可适度抑制ROS的生成(图。6摄氏度).BIOREVO荧光观察反映了图的强度。因此,人们发现1 d不会被细胞吸收而产生活性氧,紫外线照射产生的活性氧水平与H2O2.利用ROS检测细胞基础检测试剂盒(DHE)进行了比较实验,结果表明1 d与众所周知的强效光敏剂Rose Bengal相似,且高于临床实际用于PDT的染料Talaporifin钠,这表明1 d具有较高的ROS生成效率(补充图。9).
细胞死亡机制
接下来,我们使用凋亡标记如Annexin V和碘化丙啶(PI)来研究细胞死亡是否由凋亡引起(图。7 a、b、补充图。10用于放大细胞成像)。荧光没有观察到从膜联蛋白V或从PI(核)应用1 d在没有紫外线照射的情况下,支持图中使用WST-8的细胞毒性测定结果。2- - - - - -4.在检测PI的波长(例如555 nm, em. 560)观察到的弱细胞质荧光是来自被合并物的发光1 d.500 μM H处理2O2在细胞膜上诱导Annexin V衍生的荧光,但没有诱导PI衍生的荧光,提示细胞早期凋亡(Annexin V阳性,PI阴性)。同时施用NAC后,Annexin V的荧光消失,证实自由基清除剂抑制了H2O2.另一方面,在紫外光照射下,利用膜联蛋白v衍生的荧光观察1 d未观察到pi衍生荧光。此外,没有荧光检测到没有处理1 d.由此可见,组合的1 d紫外光对细胞凋亡的诱导作用与H2O2.NAC的共存使Annexin V呈阴性,说明产生的ROS引起了细胞凋亡。进一步的详细机制目前正在调查,到目前为止已经揭示了硝基1 d没有产生其他细胞毒性物质,如NO和ONOO−31,32.
Ferroptosis
最后,我们探讨了铁下垂参与ros相关细胞死亡的可能性1 d.铁下垂是一种程序性细胞死亡,其特征是铁代谢失调和脂质过氧化物的积累33.在铁他汀-1作为铁下垂抑制剂的存在下,紫外线诱导的细胞毒性1 d在低浓度的紫外线照射下(10和20 μ M1 d).另一方面,50µM的1 d并没有被铁抑素-1抵消(图;8 a、b).此外,我们在处理过的细胞中检测到不稳定铁1 d通过荧光团Mito-FerroGreen(图。8 c、补充图。11用于放大细胞成像)。这些结果表明1 d紫外线照射可引起铁下垂(低剂量)和细胞凋亡(高剂量)。由于许多铁下垂诱导剂至今未见报道,1 d可用作诱导剂,可在紫外线照射下开启铁上睑下垂。据我们所知,这是刺激响应性铁下垂诱导剂的第一个例子。
结论
综上所述,我们开发了一种基于1,3a,6a-三氮戊二烯(TAP)的非常规光诱导细胞毒小型荧光染料。在各种2-取代的TAP衍生物中,2-p-nitrophenyl-TAP1 d对HeLa细胞表现出强烈的光诱导细胞毒性。光诱导的细胞毒活性1 d对癌细胞的活性随癌症类型的不同而有显著的变化,并且活性与剂量相关1 d被关进牢房。由于TAP骨架是我们实验室最初开发的荧光染料,2-p-nitrophenyl-TAP (1 d)是一种用于光动力疗法(PDT)的非常规ros产生染料。由于常规用于PDT的染料大多局限于卟啉、酞菁、荧光素等相对较大的分子,很难在不失去其生物活性的情况下引入到药物或天然产物等具有靶标亲和力的小分子中。TAP模拟器件的紧凑尺寸有望支持PDT的进一步发展。虽然使用紫外线作为光源往往是有问题的,因为它对组织的穿透和细胞毒性有限,宫颈癌和结直肠癌1 d经内窥镜直接照射可有效治疗。此外,本研究中紫外线照射条件未表现出明显的细胞毒性。因此,应用1 d下一个课题是可以直接用紫外线照射的结直肠癌、宫颈癌、皮肤癌和口腔癌体内实验的衍生品。同时,实现了实际应用1 d到PDT,进一步研究更长的波长位移和共轭1 d靶向亲和分子仍然是必需的。众所周知,取代基可以用来调节TAPs的波长,我们已经合成了几种在可见光区域吸收极大值的衍生物。我们目前正在开发的衍生品1 d波长更长。
在本研究中,揭示了TAP可以作为ROS生成染料,揭示了TAP作为光反应前药和PDT的潜力。此外,1 d发现低浓度下有诱导上铁的作用,本研究可提供一种非传统的紫外诱导上铁的诱导剂。进一步研究阐明光诱导细胞毒性的机制1 d具体细节目前正在我们的实验室中进行。
方法
化学合成
新型TAP衍生物的详细合成过程及化合物表征(1 n,1阿,1p 1q 1r和1s)的详细资料载于补充的方法,1H和13C核磁共振谱可在补充数据中获得1.吸收光谱和荧光发射光谱也可在补充数据2.
细胞系和培养
人类细胞系HeLa, A549和HCT116由RIKEN BRC通过日本MEXT/AMED的国家生物资源项目提供。人GIST细胞株(GIST- t1)由Takahiro Taguchi (Kochi University, Kochi, Japan)提供。人类多发性骨髓瘤细胞系(RPMI8226)来自美国类型培养收藏(Manassas, VA, USA)。人星形细胞瘤细胞系(CCF-STTG1)来自DS Pharma Biomedical Co., Ltd (Osaka, Japan)。细胞在含有5%胎牛血清(FBS: Life Technologies)、70 mg/L青霉素(Sigma)和100 mg/L链霉素(Sigma)的Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM: Sigma)中培养,并在相同的培养基中维持,温度为37°C,浓度为5% CO2.
在培养基中加入TAP溶液
TAP骨架本身是亲脂的,TAP类似物的水溶性取决于取代基。由于在本研究中检测的TAP衍生物是亲脂性化合物,因此将TAP用作稀释分散的培养基。将40 μL 10 mM TAP溶液在DMSO中分别用1 mL和4 mL培养基(含5% FBS的DMEM)稀释,分别得到25 μM和100 μM溶液。
紫外线照射
将制备好的TAP溶液放在100µL的培养基中,在37℃、5% CO的条件下用癌细胞株处理2.混合物在37°C下孵育1小时,然后在距离细胞5厘米的地方用紫外灯(ASONE Handy UV lamp SLUV-6)照射1小时。
WST-8化验
癌细胞系(1 × 104)被镀在I型胶原蛋白涂层的96孔板(IWAKI)上,用含5%胎牛血清的DMEM孵育一天。用含5%化合物的DMEM代替培养基。在化合物处理和紫外线照射后,细胞用细胞计数试剂盒-8 (WST-8;Dojindo)根据制造商的说明。简单地说,将WST-8试剂溶液(10µL)添加到培养基中含有100µL细胞的96孔微孔板的每孔中,并在37℃下孵育2 h。在450nm处用酶标仪测量吸光度。细胞活力以对照(未经UV(+)或UV(−)处理的化合物)的百分比表示。细胞存活率(%)= (a-c) / (b-c) × 100 (a =各浓度化合物的吸光度,b =未经光照射或未经光照射的吸光度,c =空白吸光度)。集成电路50存活率百分比与化合物浓度的线性近似回归计算值。
共焦成像
癌细胞系(5 × 104)镀于8孔载玻片(Nunc)上,用含5%胎牛血清的DMEM孵育1天。用含5% FBS的DMEM化合物代替培养基。4°C孵育24 h后,用4%多聚甲醛(PFA)固定细胞。固定细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。标本在共聚焦荧光显微镜下观察(LSM700,卡尔蔡司)。
细胞荧光强度的测量
数字成像分析是通过一个标准成像软件连接到共聚焦显微系统在荧光模式(ZEN;卡尔蔡司)。含明显荧光的细胞为阳性细胞。观察了三个不同的区域,每个区域有20-30个细胞。细胞群中荧光的相对数量表示为每个图像中的强度指数(平均值)。在该系统中,相对荧光强度从0到255进行分级。荧光强度与显示阳性信号的像素数呈线性相关。其他细胞株的相对强度在该梯度范围内计算。
活性氧(ROS)测定
癌细胞系(2 × 104)被镀在I型胶原蛋白涂层的96孔板(IWAKI)上,用含5%胎牛血清的DMEM孵育一天。用含5% FBS化合物的DMEM或500µM H代替介质2O2作为阳性对照。在化合物处理和紫外线照射后,按照制造商的说明用ROS检测细胞检测试剂盒(Cayman chemical)处理细胞。阴性对照由N-乙酰半胱氨酸到一组未处理或处理的细胞。细胞在37℃黑暗环境下孵育1 h,吸入ROS染色缓冲液,所有孔中加入100 μl DMEM 5% FBS,在575 nm(激发:488 nm)处检测荧光。产生的ROS在对照组和处理过的细胞中表现为总DHE荧光。
膜联蛋白V测定
在化合物处理和紫外线照射后,用FITC-Annexin V和碘化丙啶溶液(Nacalai tesque)和1µg/mL Hoechst33342 (Sigma)在室温下处理HeLa细胞1 h。室温培养1 h后,用4% PFA固定细胞。固定细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗,然后在共聚焦荧光显微镜下观察标本。
Mito-FerroGreen化验
HeLa细胞用5µM Mito-FerroGreen (Dojindo)和10µM1 d在37°C下放置1小时。在化合物处理和紫外线照射后,用4%的PFA在室温下孵育1 h后固定细胞。固定细胞用Hoechst33342 (Sigma)染色,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤,然后在共聚焦荧光显微镜下观察标本。
测量吸光度/荧光光谱和荧光量子产率
吸收光谱记录在JASCO V-600光谱仪上,校正荧光光谱记录在JASCO FP-8200荧光光谱仪上。实验前用Ar气流彻底吹扫样品溶液30分钟,然后密封在细胞内。所有测量均在25°C下进行。荧光量子产率由9,10-二苯蒽(9,10- dpa)在环己烷(ΦF= 0.91)或乙醇中的罗丹明B (ΦF= 0.94)作为标准。数值由Eq计算。1.
std:标准品,x:样品,A:激发波长处的吸光度,F:荧光光谱面积,n:折射率
统计数据
使用Student 's进行组间比较t以及。数据以均数±标准差表示,在P< 0.05。
报告总结
关于研究设计的更多信息可在与本文链接的《自然》投资组合报告摘要中获得。
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确认
作者感谢F. Yagishita博士(德岛大学后LED光子学研究所)提供各种LED灯。这项工作得到了日本科学技术委员会(JSPS) KAKENHI资助号JP21K19051和JP22H00352的部分支持,以及德岛大学的研究集群计划(No. 1802001)。
作者信息
作者及隶属关系
贡献
K.N.构想了化学实验并分析了结果。D.T.构想了生物实验并分析了结果。a.n., r.y., s.n., T. Taniguchi, S.K.和R.S.进行了实验室实验并优化了反应条件。N.M.和T.高山提供癌细胞。k。n。和d。t。写论文,k。i。校对论文。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者声明没有利益竞争。
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辻,D,中山,A,山本,R。et al。1,3a,6a-三氮戊二烯衍生物的光诱导细胞毒性小荧光染料。Commun化学6, 37(2023)。https://doi.org/10.1038/s42004-023-00838-0
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