刺鼠信号蛋白的异常表达(gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba)是导致儿童单基因严重肥胖的原因之一gydF4y2Ba

虽然常见的肥胖无疑有遗传成分，但单基因形式的人类肥胖是非常罕见的gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba}．这些单基因缺陷大多影响瘦素-黑素皮质素4受体(MC4R)通路，该通路主要调节食物摄入和能量平衡gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba}．这些检测gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba以及新的单基因肥胖特征gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba这不仅会提高我们对人类肥胖机制的理解，而且还会指导新的靶向药物治疗的开发，越来越多地用于受影响的患者gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

在自下而上的方法中，利用患者来源的脂肪细胞，我们确定了黑素皮质素肥胖综合征的一个潜在的新遗传原因，表型复制小鼠和人类原黑素皮质素(gydF4y2BaPOMCgydF4y2Ba)缺乏症和老鼠gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba突变体(所谓的“刺豚鼠”)。gydF4y2Ba

一名非血缘欧洲血统的女孩在1.9岁时首次出现过度生长和严重肥胖。据报道，从婴儿时期起，她就对食物有持续的渴望，并发展为进行性的极端肥胖和高身材(图。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)在儿童早期伴有严重高胰岛素血症和肝脂肪变性的最初症状(图。gydF4y2Ba1碳氢键gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

父母双方都患有肥胖症(图2)。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba)．这位父亲患有2型糖尿病、高血压和痛风。在明显的表型特征(红发、白皮肤和雀斑)上，这个女孩很像她的父亲。通过全外显子组测序，排除了与单基因肥胖和其他遗传性疾病相关的基因的临床相关变异。12.4岁时体重指数(BMI)为47.6 kg mgydF4y2Ba^{−gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba}(BMI s.d.评分(SDS) 3.8，体重156 kg，身高181 cm, SDS 3.34)，她接受了袖状胃切除术的减肥手术，体重减轻了40 kg。她随后体重回升，但代谢改善仍在。gydF4y2Ba1 a -gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在儿童时期，患者报告持续饥饿，除非吃了大量的食物。她有意识地控制食物的摄入量。16岁时，她在饮食失调检查问卷和荷兰饮食行为问卷中得分很高，表现出高度的认知克制(>第85百分位)以及极端的饮食、体重和形状担忧(>第95百分位)。她没有报告暴食、外部进食(<第5百分位)或情绪性进食(<第25百分位)。gydF4y2Ba

一项临床心理学研究发现，他们的身体活动非常少。此外，间接量热法显示静息代谢率降低(1,660千卡/天gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，仅为预期的77.4%)。gydF4y2Ba

因此，这种伴有高身材、低色素、食欲和能量消耗改变的早发性极端肥胖的表型提示可能是潜在的遗传或生物学原因。gydF4y2Ba

生物学改变和异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba脂肪组织的表达gydF4y2Ba

我们在减肥手术中从病人身上获得了皮下脂肪组织样本。考虑到严重的过度生长和肥胖，我们假设脂肪组织来源的基质血管分数(SVF)细胞显示了增殖和/或成脂能力的改变。与4个年龄匹配的肥胖对照组的SVF细胞相比，患者的SVF细胞在长期培养中显示出明显的脂肪细胞分化(补充附录，补充表)gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba和无花果。gydF4y2Ba2模拟gydF4y2Ba)，而患者的SVF细胞增殖没有增强(图。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba)．我们进一步发现，患者SVF细胞中线粒体最大呼吸量、空闲容量和质子泄漏的减少作为能量消耗减少的替代。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了确定脂肪形成增强的潜在分子原因，我们通过转录组范围的分析，与对照组儿童的SVF细胞相比，在患者的SVF细胞中寻找差异表达基因。只有一个基因编码gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在指标患者的细胞中高度过表达(图;gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们确认了异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在几种细胞类型中表达，包括分离的脂肪细胞，SVF细胞和外周血白细胞，表明在患者中普遍表达(图。gydF4y2Ba3罪犯gydF4y2Ba、补充附录及补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．同时，我们在患者细胞的SVF细胞裂解液和条件培养基中发现异位ASIP蛋白。抑制分泌途径导致细胞保留ASIP，证实异位表达的ASIP是分泌的gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

生理上,gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在皮肤中表达，并通过与黑素皮质素-1受体(MC1R)相互作用来调节头发的色素沉着。老鼠无处不在的表情gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba由于食物摄入量增加，脂肪组织中的脂质储存和能量消耗减少，所谓刺豚鼠中的同源nonagouti导致黄色皮毛和肥胖gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．因此，和谐的表型与异位表达有关gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在我们的参与者中很可能是人类中一种新的单基因肥胖原因。gydF4y2Ba

染色体重排导致异常异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达式gydF4y2Ba

根据我们发现的异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba患者的表达，我们假设gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba基因位点改变。包括三组全基因组测序(WGS)、拷贝数变异筛选(CNV)和断点序列克隆在内的遗传分析显示，在20号染色体上有一个包含邻近基因的183 kbp杂合串联重复gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba以及瘙痒E3泛素蛋白连接酶gydF4y2Ba(痒gydF4y2Ba)在正向链和腺苷同型半胱氨酸酶上gydF4y2Ba(AHCY)gydF4y2Ba在反链上(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．肥胖相关基因的其他临床相关变异或CNVs，如gydF4y2Ba中的gydF4y2Ba，gydF4y2BaPOMCgydF4y2Ba而且gydF4y2BaLEPRgydF4y2Ba被外显子组测序和TruSight One测序小组排除。gydF4y2Ba

这两个,gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba在全转录组分析中没有差异调控(图;gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)， SVF细胞的实时荧光定量PCR结果显示gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba表达和没有区别gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba表达式(扩展数据图。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba),而gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba过表达数倍(扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．外周血白细胞也得到了类似的结果(图2)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba)．这与基因组重排产生三个副本的预期是一致的gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba基因的数量没有变化gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba编码外显子和启动子使用驱动开关gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba基因的表达由无处不在的活跃gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子。gydF4y2Ba

我们看到略有增加gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba表达时，我们更详细地研究了AHCY的影响;然而，实验过度表达gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba在人Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS)前脂肪细胞中gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba不影响脂肪细胞分化或过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的表达(gydF4y2BaPPARGgydF4y2Ba)作为脂肪形成的主要调节因子(扩展数据图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．因此，染色体重排突变的主要后果是异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

我们的指示病人遗传了她父亲的突变，异位就是证据gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba外周血白细胞的表达(图;gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)和重复特异性的存在gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba通过WGS和断点特异性定量聚合酶链反应(qPCR)确定的断点序列(图;gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．这位父亲也有同样的染色体重排，据自述，他从出生起就比同龄人更高更重。从10岁开始，他开始参加竞技体育运动，体重有所下降。尽管如此，他在18岁时报告体重为125公斤(BMI 36 kg m)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba})．然而，在52岁的时候，他在饮食行为问卷上的得分并不明显。gydF4y2Ba

病人和她的父亲都有红色的头发颜色和苍白的皮肤和雀斑(图。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba)，这是另一个与刺鼠异位表现的黄色皮毛相一致的特征gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba这是由于ASIP作为皮肤中的MC1R拮抗剂的作用。我们证实了病人和父亲都没有携带任何已知与红头发有关的基因变异，例如gydF4y2Ba受体gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba(补充附录及补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

通过5 '快速扩增互补DNA末端和PCR (5 ' -RACE-PCR)以及来自外周血和SVF细胞的RNA-seq，我们证明了遗传重排产生了一个gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba抄本由前两个非编码组成gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba外显子(5 ' untranslation region (UTR))融合到gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba编码外显子(图;gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．这表明gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达是受控制的gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子。和GTEx的目录一致，我们发现嗑药了gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba基因在皮肤中的表达和在其他健康人体组织中的低表达(图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．作为gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba在人体组织中普遍表达(图;gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba并与GTEx目录相一致)，它解释了无处不在的表达gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在我们的病人身上。gydF4y2Ba

我们验证了功能gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba荧光素酶报告基因分析的相互作用显示一个2.8 kbp的基因组区域位于上游gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba外显子1能够驱动基因的表达(图;gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．此外，我们还克隆了一个人工融合基因gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合cDNA序列受控于2.8 kbpgydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子，并证实增加ASIP蛋白的生产和分泌(图;gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)的存在与否无关gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba5 ' utr(无花果。gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

由此，染色体重排定位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在控制之下gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子是事业的无处不在的表达gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在我们的患者中，可能因此导致了我们患者的临床表型:早发性极端肥胖，饮食行为改变，能量消耗减少和色素下降。gydF4y2Ba

保留异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在患者来源的iPSCs中的表达gydF4y2Ba

要造成这种类似刺鼠的表型，需要gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba中央(下丘脑)回路的表达。由于这些自然不能直接从患者样本中获得，并提供进一步的支持，即患者的基因重排引起普遍存在gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在所有来源的细胞中，我们从患者来源的SVF细胞和两个对照儿童中生成诱导多能干细胞(iPSCs)。异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba与对照组相比，患者的iPSCs表达持续存在(与对照组相比约500倍;无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),而gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba只是略有增加(约1.25倍)和gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba与控制相比，没有不同的表达(扩展数据图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．我们证实ASIP蛋白也分泌到患者iPSCs的上清中(图2)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．我们进一步将患者和对照组的诱导多能干细胞分化为中胚层、外胚层和内胚层的细胞，并发现异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在所有胚层分化后，在患者来源的iPSCs中表达，而不在对照组中表达(图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．由于怀疑的作用方式是下丘脑异位ASIP作用，我们继续进行并证实gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba过度表达患者来源的iPSCs通过神经元祖细胞分化为下丘脑样神经元(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

最后，为了从实验上证实ASIP不仅在MC1R上也在MC4R上发挥拮抗作用，我们在瞬时转染人CHO-K1细胞中进行了cAMP积累实验gydF4y2Ba受体gydF4y2Ba或gydF4y2Ba中的gydF4y2Ba．随着ASIP浓度的增加，人MC1R和MC4R的基础活性均以半最大抑制浓度(IC)降低gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)分别为4.4 nM和16.9 nM。天然配体α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)对两种受体都具有激动活性(MC1R半最大有效浓度(ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba) = 2.3 nM;中的电子商务gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba= 10.6 nM)，但100 nM ASIP的存在导致两个受体α-MSH的效力降低，MC1R (ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba= 65 nM)和MC4R (ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba= 149 nM)(图;gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因此，nonagouti同系词的表达无处不在gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在所有三个胚层的患者来源的细胞中都发现了异位ASIP，支持这一假设，即异位ASIP在我们患者的下丘脑中拮抗MC4R信号，这将影响与饮食行为和能量消耗相关的过程，从而影响肥胖表型。gydF4y2Ba

其他患者的鉴定gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba突变gydF4y2Ba

这种类型的遗传重排不容易通过标准的遗传筛查检测到，传统的重点是单核苷酸变异。这可能解释了为什么没有发现病例gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba英国生物银行存款或文献中的突变。gydF4y2Ba

我们筛选了具有POMC通路缺陷表型(极端肥胖和红发色)的目标20例患者gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba最初怀疑但未确诊的变异gydF4y2BaPOMCgydF4y2Ba缺乏。然而，我们没有发现有类似的患者gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

莱比锡儿童肥胖队列的针对性筛查(gydF4y2BangydF4y2Ba= 1745)发现另外4名患者(3名女孩和1名男孩)携带完全相同的5 '基因突变。gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合作为我们的指标患者(表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．其中3例可从外周血中提取RNA并异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达得到证实(图;gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．所有4例患者均患有严重的儿童肥胖(表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．与肥胖组相比，大多数患者携带gydF4y2BaASIPgydF4y2BaBMI SDS和身高SDS均高于中位数(图2)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．值得注意的是，其中一位患者有一个双胞胎兄弟，他没有携带这种突变。虽然两兄弟均存在肥胖，但肥胖程度不一致(>体重差异25 kg, BMI SDS差异0.67;身高差8.8 cm，身高差SDS 1.18;他们都只有11岁;表格gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了进一步支持已确定的串联复制和儿童肥胖之间的联系，我们筛选了健康的儿童人群队列(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2051)。我们进行了幂次计算，假设普通儿科人群中的患病率与我们在肥胖组中观察到的患病率相同(0.28%)。据此，在80%的幂值(显著性水平0.05)下，筛选2154个先证物足以识别6个乙肝病毒携带者gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba突变(对应359分之一)。在我们筛选的2051个健康人群队列中，我们没有发现任何先证物(gydF4y2BaPgydF4y2BaFisher精确检验和Monte Carlo模拟卡方检验= 0.02)，进一步支持串联重复确实与肥胖有关。gydF4y2Ba

因此，即使在我们的本地样本中，识别额外的、不相关的患者，也有望检测到更多的无所不在的患者gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达如果遗传诊断算法扩展到染色体重排。gydF4y2Ba

我们报告了一种类似刺鼠的人类单基因肥胖特征，表现为极端早发性肥胖，加速线性生长，超出了肥胖儿童的预期gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba和hypopigmentation。基于对患者来源的原生细胞和iPS细胞分析的实验数据，我们确定了普遍存在的异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba由于染色体重排的表达作为表型的可能原因(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

所识别的串联复制导致异位表达的产生gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合信使RNA的控制下，自然无处不在的活跃gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子，导致分泌的ASIP蛋白水平增加。与此相符，我们发现异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba患者几种细胞类型(如脂肪细胞和外周血白细胞)的表达。即使理想，我们也不能表现出异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba直接在功能性下丘脑/大脑回路中表达，因为我们自然无法接触到这些患者组织;然而，患者来源的iPSCs分化为所有胚层细胞，并进一步分化为下丘脑样神经元，保持异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达式。这些发现和事实一起gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba在大脑和下丘脑中检测到表达，ASIP在MC1R和MC4R中起拮抗剂的作用，支持这一观点gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在病人的下丘脑有异位表达。gydF4y2Ba

的小鼠gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba众所周知，nonagouti与啮齿类动物的肥胖有关。人类的编码区gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba基因85%与小鼠基因同源gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba有很高的功能守恒gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．与我们的患者一致的是，一些无刺豚鼠普遍异位表达的啮齿动物模型出现了肥胖、体长、黄毛和高胰岛素血症的增加gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．值得注意的是，这与自然产生的刺豚鼠相似gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba,异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba我们患者的表达是由基因重排引起的，导致启动子使用的改变，因此普遍存在和异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达式。值得注意的是，有一种转基因刺豚鼠模型，在其中表达小鼠gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba同源物是由无处不在的活跃的人类β-肌动蛋白启动子驱动的，因此我们在患者身上发现了非常相似的遗传星座。这些小鼠表现出过度表达gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在大脑中，导致肥胖表型，伴有贪食症和高胰岛素血症gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

生理上,gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba基因在毛囊中表达，拮抗黑色素细胞上MC1R的功能，其异位表达，从而引起小鼠黄毛。虽然人类ASIP的生理功能似乎还不完全清楚，但我们和其他人已经表明它具有药理活性，并能拮抗人类黑素皮质素受体gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．此外，全基因组关联研究揭示了变异之间的关联gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba与肤色、黑素瘤风险和红毛颜色有关的基因位点，指向与其他哺乳动物相似的毛发和皮肤色素沉着的生理功能。然而，我们没有发现变异gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba或gydF4y2Ba受体gydF4y2Ba在我们的指标患者中与红头发相关，从而表明色素沉着表型源于功能性过表达gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba．除此之外，Voisey等人的一项研究表明gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在成人先证者中，脂肪细胞mRNA水平与BMI呈性别特异性相关，在男性和女性中方向相反gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．与此相反，我们发现没有或只有虚假gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在莱比锡儿童脂肪组织队列儿童皮下脂肪组织样本中的表达gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

小鼠非刺鼠/ASIP和人类ASIP与刺鼠相关肽共享结构相似性解释了肥胖表型gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．当ASIP在下丘脑异位表达时，假设ASIP通过竞争性地对抗MC4R上的天然配体α-黑素细胞刺激激素来干扰瘦素-黑素皮质素轴，从而集中影响食物摄入和能量消耗;然而，无处不在的表达gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba据报道，与瘦素或瘦素受体缺乏的小鼠相比，在小鼠中导致相当中度的嗜食gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba．同样地，我们的病人在减肥手术前报告了与饱腹感作斗争，并表现出克制的饮食，表明她有意识地抵消了她感觉到的嗜食冲动。减肥手术后肠促素水平的升高可能影响了患者的神经元MC4R信号，进一步促进了节制饮食gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．除了嗜食症，其他机制也可能影响肥胖的发展gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}．下丘脑中的刺鼠相关肽影响能量消耗gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba，运动活动gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba和交感神经以及基底利用的变化gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba在周围组织中。异位ASIP可能有类似的效果。事实上，我们观察到患者自发体力活动减少，并观察到整个身体和细胞水平的静息代谢率下降，这可能至少部分导致了肥胖表型。父亲患有肥胖症和糖尿病，一头红发。在童年和青少年时期，他积极参加竞技运动，这对能量平衡有好处，但并不能完全防止肥胖。例如，在肥胖的其他单基因原因中也已知可变表型-基因型一致性gydF4y2Ba中的gydF4y2Ba突变gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．有人说过gydF4y2Ba中的gydF4y2Ba突变和变异体表现出部分外显性和年龄依赖性表达gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．值得注意的是，我们的指标患者报告说，她的头发随着年龄的增长而变化，从深红色(学步时)到更红和棕色(现在是年轻人)，这可能表明基因型-表型关联的表达性发生了类似的改变。尽管异位ASIP最可能主要通过中枢效应促进肥胖，但异位ASIP也可能通过外周效应促进肥胖，如所述的胰腺胰岛素分泌增强、脂肪细胞瘦素分泌、脂肪细胞中脂质溶解活性降低或脂肪生成转录因子的调节gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}它甚至可能影响棕色AT的激活gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．与此相一致，患者表现出高胰岛素血症，她的SVF细胞比对照组的SVF细胞更好地分化为脂肪细胞，这表明泛在性脂肪对外周肥胖相关的影响gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达式。潜在地，原发性高胰岛素血症也可能驱动线性过度生长，正如最近显示的表观遗传驱动的高胰岛素血症导致小鼠巨人症gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

值得注意的是，尽管患者在减肥手术后出现了明显的体重反弹，但她表现出持续的代谢改善。除了患者所描述的限制性饮食行为和/或对肠促素平衡的潜在持续影响外gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba另一个可能的解释可能是接受手术的患者年龄较小，因为先前的研究表明，与老年患者相比，青少年减肥手术在缓解糖尿病和高血压方面的益处更高gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

可能还有更多未确诊的异位患者gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达，即围绕的轨迹gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba易受基因重排影响gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．事实上，有CNVs的患者已经在公开的数据库(例如DECIPHER)中被描述过。这些主要是较大的> 1mbps的删除。然而，CNV增益本身(保留内源性启动子连接)并不足以用于无所不在和异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达式。这完全依赖于断点和重新连接点的位置。在我们的患者中，特定串联复制和断点/再插入点的关键后果是一个副本gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba被置于无所不在的控制之下gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子，这会导致异位gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

这种功能获得突变在其他物种中也有描述gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}和类似的重复导致gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba绵羊中已观察到融合基因gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba在鹌鹑中gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．然而，染色体重排不容易被常规测序方法检测到，而是需要识别CNVs的技术。只有通过有针对性的重新评估，我们才能在1745名超重和肥胖儿童队列中发现另外4名患者携带与我们的指标患者相同的基因组重排。这也与异位有关gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在血细胞中的表达进一步支持了导致异位的串联复制的发现gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达和肥胖表型。其实频率为~0.28%gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在这个儿童肥胖队列中的突变甚至可能达到gydF4y2Ba中的gydF4y2Ba突变患病率，迄今为止最常见的单基因肥胖特征gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．筛查更多的患者来证实这一点，并明确这种由异位引起的单基因特征的表型gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba表达是相关的，特别是作为MCR激动剂，如最近批准的用于瘦素-黑素皮质素信号通路成分不足的setmelanotidegydF4y2Ba^7gydF4y2Ba，为这些病人提供有希望的治疗选择;然而，与setmelanotide同时刺激MC1R会导致皮肤色素沉着，并可能改变黑色素瘤风险gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba．另一种治疗方案可能是胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂，因为它们已被证明可以介导糖尿病患者的体重减轻gydF4y2Ba中的gydF4y2Ba突变程度与多基因肥胖患者相似gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba；然而，他们不会针对MC4R的潜在病理机制。选择性MC4R或专门针对下丘脑神经元的激动剂将构成一种有前途的治疗选择gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

总之，我们报告了基因组重排导致无处不在的表达gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba患有严重早发性肥胖和过度生长的患者。该表型与异位表达nonagouti/ASIP的小鼠刺豚鼠肥胖模型一致。小鼠和人类的ASIP都干扰黑素皮质素受体信号，这可能解释了肥胖表型。gydF4y2Ba

监督gydF4y2Ba

对照组的指标患者和儿童为莱比锡儿童脂肪组织研究的参与者gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba（gydF4y2BaNCT02208141gydF4y2Ba，gydF4y2Bahttps://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02208141gydF4y2Ba(2014年8月首次注册)和莱比锡儿童肥胖(gydF4y2BaNCT04491344gydF4y2Ba，gydF4y2Bahttps://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04491344gydF4y2Ba(2020年7月首次注册)的队列gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．12岁的儿童及其监护人提供了知情同意。这些研究得到了莱比锡大学伦理委员会的批准(265/ 08,007 /04)。gydF4y2Ba

临床和饮食行为数据，能量消耗gydF4y2Ba

使用校准设备分别测量身高和体重，测量结果分别为1mm和0.1 kg。BMI和身高根据现行指南参考性别和年龄gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba并以sds的形式发放根据目前的国家共识指南，将儿童分为超重组(1.28 < BMI SDS≤1.88)或肥胖组(BMI SDS > 1.88)gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

血液参数由莱比锡大学检验医学研究所的标准实验室程序测量。gydF4y2Ba

饮食行为是通过使用有效问卷的自我报告来评估的。饮食失调检查问卷gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}评估进食障碍的精神病理与subscales克制，饮食，体重和形状的关注和行为特征(例如暴食)。将患者评分与1354名<44岁女性的参考人群进行比较gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba父亲对1166名44-64岁男性的参考人群的得分(参考文献)。gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba)．荷兰饮食行为问卷gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba用李克特量表的和分数评估情绪化进食、外部进食和克制。患者评分与1394名14-94岁女性的参考人群进行比较gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

根据制造商的方案，在15岁时，在一夜禁食后使用间接量热计(夸克RMR，德国Cosmed)检查患者的静息能量消耗。预期代谢率是根据她的年龄、性别、身高和体重计算的。gydF4y2Ba

脂肪组织SVF细胞的分离与培养gydF4y2Ba

皮下AT样本取自接受减肥或择期骨科手术的儿童(补充表)gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．如前所述，SVF细胞和脂肪细胞被分离并保存以供以后的RNA分离gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}．剩余的SVF细胞通过孔径为30微米的尼龙网过滤。用红细胞裂解缓冲液(0.154 M NH)去除红细胞gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}Cl (Sigma-Aldrich)， 0.01 M KHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(Merck)和0.1 mM EDTA (Sigma-Aldrich))。SVF细胞冷冻在含有10%胎牛血清(FBS) (Biochrom)和10%二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich)的Dulbecco改良Eagle培养基/Ham F-12培养基(DMEM/F-12) (Life Technologies)的液氮中。将细胞解冻，种子细胞24 h后用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，通过塑料粘附选择脂肪细胞前体细胞。分离的SVF细胞在含10%胎牛血清、100 U青霉素、0.1 mg ml的DMEM/Ham F-12培养基中培养gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}链霉素(Sigma-Aldrich)在37°C和5% COgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}每3-4 d传代一次。gydF4y2Ba

功能效应gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba超表达gydF4y2Ba

人类SGBS细胞由M. Wabitsch(乌尔姆大学)提供，并按照前面描述的方式培养gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

pCMV质粒转染采用Neon转染System 100µl试剂盒(Invitrogen)进行。电穿孔方案优化为脉冲电压1300 V，脉冲宽度20 ms，脉冲数2，细胞密度6 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．用5µg pCMV-AHCY质粒转染SGBS细胞gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba过表达或pCMV-Entry(均为oriGene)作为对照，每1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞。电穿孔后，每孔50万个细胞以12孔格式进行分化试验。gydF4y2Ba

扩散分析gydF4y2Ba

为了评估SVF细胞的增殖情况，在培养的第49、71和89天，每孔分别在96孔板中接种500个SVF细胞，分为5个重复，培养8 d。1 d和8 d后，根据制造商的方案，使用WST-1法(Roche, Applied Bioscience)评估细胞活力。细胞固定后，用Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich)染色，显微镜计数。d1与d8之间的加倍时间(天)计算为(持续时间(8 d) × loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(2)) / (loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(每张图像的单元格数d1) - loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(每张图像的单元格数d8))gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

分化分析gydF4y2Ba

为了评估成脂能力，在技术三次复制中，在培养的第34、49、71和89天，每孔在48孔培养皿中播种3万个SVF细胞，或在12孔培养皿中使用转染的SGBS细胞。细胞培养至融合24至48小时，并根据Poietics人类脂肪来源干细胞-脂肪生成协议(Lonza)分化8 d (SVF细胞)或10 d(转染的SGBS细胞)。gydF4y2Ba

分化细胞用Roti-Histofix 4% (Carl Roth)固定，10µg ml双染色gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}尼罗红(Sigma-Aldrich) 40µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich)。分化细胞的百分率为的平均值gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术重复，计算公式为(每张显微图像计数的分化细胞数)/(每张图像的总细胞数)。当含有至少两个脂滴时，细胞被定义为已分化。此外，细胞用Oil Red O (Sigma-Aldrich)溶液(0.3%在60%异丙醇中)染色15分钟，用HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}用异丙醇提取油红O，在540 nm处测定吸光度。gydF4y2Ba

生物能量学分析gydF4y2Ba

线粒体功能使用Seahorse XFe24分析仪(Agilent Technologies)和XF细胞Mito压力测试试剂盒(Agilent Technologies)进行评估，使用浓度为2µM的寡霉素、3µM的甲酰氰-4(三氟甲氧基)苯基肼和1µM的鱼藤酮/抗霉素A。患者或对照儿童共15,000个SVF细胞，在3 -4个技术重复中被植入明胶包裹的XFe24板孔中。转染后48小时，使用XF基础培养基(安捷伦技术公司)进行测量，该培养基含有2mm丙酮酸盐(Sigma-Aldrich)、10 mM葡萄糖(Sigma-Aldrich)和2 mM谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)。通过在30 μ l 50 mM NaCl溶液(Carl Roth)中溶解细胞，将结果归一化为每孔总蛋白(µg)，随后使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行蛋白定量。gydF4y2Ba

核酸的分离gydF4y2Ba

RNA从SVF细胞中分离出来，如前所述进行逆转录gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba．使用PAXgene血液RNA管协议(PreAnalytics)从血液中提取RNA。从Clontech-TakaraBio获得来自不同个体的不同人体组织的RNA。使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(QIAGEN)从EDTA血液样本中提取基因组DNA。gydF4y2Ba

Transcriptome-wide分析gydF4y2Ba

使用HumanHT-12 v4 BeadChip阵列(Illumina)检测基因表达。使用R包limma进行预处理(即背景校正和分位数归一化)和差异基因表达分析gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba（gydF4y2Bahttps://doi.org/10.5281/zenodo.7223530gydF4y2Ba)．折叠变化为对数gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}转换和gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用Benjamini-Hochberg程序(FDR)对数值进行多次测试调整。gydF4y2Ba

中存在gydF4y2Ba

定量实时PCR (qRT-PCR)如前所述gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba使用qantstudio3实时PCR系统(Applied Biosystems)和qPCR Master Mix Plus - Low ROX (Eurogentec)或Takyon Low ROX Probe Master Mix dTTP Blue (Eurogentec)。基因表达的定量使用从包含目标序列的线性化质粒或从参考样品连续稀释的标准曲线。基因表达归一化为β-肌动蛋白和tata -box结合蛋白的表达。用于测量gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba在来自莱比锡脂肪组织儿童队列的皮下脂肪组织样本中表达的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶被用作第三个参比基因。补充附录和补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba列出了用于qRT-PCR的引物和探针的所有序列以及TaqMan基因表达测定(赛默飞世尔科学公司)。gydF4y2Ba

5 ' -RACE-PCRgydF4y2Ba

使用smart RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)从外周血RNA中使用补充附录和补充表中的引物进行5 ' -RACE-PCRgydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

rna测序和转录本分析gydF4y2Ba

用TRI REAGENT (Sigma-Aldrich)从患者和对照儿童1-4的SVF细胞中分离RNA，从患者和对照儿童9的外周血单个核细胞中分离RNA。RNA数量用光谱仪(Nanodrop ND 1000)测定。我们只纳入了在Agilent 2100生物分析仪上使用RNA 6000纳米芯片(Agilent Technologies)分析的RIN值>8的RNA样本。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒v2 (Illumina)生成索引cDNA文库。在安捷伦2100生物分析仪和DNA 1000芯片上测定的平均文库大小为300 bp。这些文库在Illumina hisansq测序系统(Macrogen)上测序。gydF4y2Ba

Reads被映射到参考人类基因组(GRCh38。p13, INSDC Assembly GCA_000001405.28, 2013年12月)使用TopHat (v.2.1.1)gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba．使用samtools进行索引后(v.1.9)gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba映射的读取被组装成转录本并通过StringTie进行量化(v. 2.2.3 b)gydF4y2Ba^{52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}．对于TopHat，我们使用“默认”参数。StringTie参数“read coverage”(-c)，“transcript length”(-m)和“base on both sides of a junction a spliced read has to cover”(-a)被设置为最小值。参数“一个位点上最丰富的转录本的比例”(-f)从默认值(0.01)降低到0，因为在比较分析后对伪像和未完全加工的mRNA进行了校正，截断值为1%。对于所有其他StringTie参数使用默认值。用集成基因组查看器(Broad Institute)检查组装的转录本gydF4y2Ba^{54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba}由于寡核苷酸- dt /poly-A引物选择而显示明显3 '偏倚的样品不包括在内。gydF4y2Ba

由于外显子的尺寸较小gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba而且gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba单外显子的覆盖和分析是不可能的。相反，从头组装gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba而且gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba使用StringTie执行转录。三种新的转录变异只包含前两个注释的外显子gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba．每千克碱基每百万的片段为这些变体和gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba而且gydF4y2BaAHCYgydF4y2Ba比较了患者和对照组之间的转录本。gydF4y2Ba

基因组和遗传分析gydF4y2Ba

在dresden概念基因组中心进行了三组WGS和生物信息学分析。超声剪切800 ng gDNA (LE220, Covaris)后，使用Kapa HyperPlus试剂盒(Roche)根据制造商说明制备DNA文库。在用唯一双索引适配器(IDT)结扎后，通过添加XP珠(Beckmann Coulter)以1:9 .9的比例去除未结扎的适配器。然后用XP珠选择DNA文库的大小，平均插入大小为300 bp，并通过qPCR (LightCycler 480, Roche)和片段分析仪(Agilent)进行定量。在NovaSeq 6000 (Illumina)上对末端为2 × 150 bp的文库进行测序，覆盖范围为>38×。使用Illumina DRAGEN管道(07.021.595.3.7.5)进行生物信息学分析。gydF4y2Ba

在使用Nextera DNA Flex Pre-Enrichment LibraryPrep和enrichment、Illumina Nextera UD指数的IDT和使用Illumina NextSeq 500/550高输出v2试剂盒(300个循环)后进行TruSight One测序面板。使用Varvis和Varfeed (Limbus)软件分析数据。所有分析均按照美国医学遗传学和基因组学学院的标准进行。gydF4y2Ba

采用Infinium CytoSNP-850K v.1.2 BeadChip (Illumina)进行阵列比较基因组杂交，并使用BlueFuse Multi (v.4.4)进行分子核型分析。gydF4y2Ba

荧光素酶报告和表达测定gydF4y2Ba

DNA序列根据TOPO TA克隆试剂盒，双启动子协议克隆，并由莱比锡大学DNA技术核心单元测序确认。用于克隆的引物见补充附录和补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

荧光素酶测定gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子通过限制性内切酶将荧光素酶报告基因上游插入pGL3-Basic载体gydF4y2Ba囊gydF4y2Ba我和gydF4y2BaXhogydF4y2Ba我。gydF4y2Ba

用于生成修饰的pgl3 -基本表达载体gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba或者是gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba控制下的编码序列gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba或无启动子时，将荧光素酶报告基因从pGL3-Basic载体中剪切gydF4y2Ba以区域gydF4y2Ba我和gydF4y2BaXbagydF4y2Ba插入I和克隆的mRNA序列。随后，启动子序列gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba是用限制性内切酶插入这些载体的吗gydF4y2Ba囊gydF4y2Ba我和gydF4y2BaXhogydF4y2Ba我。gydF4y2Ba

的编码序列的第二独立表达式向量gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba熔合到的5 ' UTRgydF4y2Ba痒gydF4y2Ba由gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子(转录起始点上游2.8 kbp)由Taconic Bioscience生成，见Supplementary Appendix和Supplementary Fig。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对于荧光素酶报告基因检测，每孔(6孔培养皿)播种50万个人胚胎肾细胞系293 (HEK293) (Sigma-Aldrich, ECACC 85120602)细胞，并在播种24小时后与1µg含有萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3-Basic质粒在2868 bp的控制下共转染gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba启动子序列或无启动子和50 ng含有荧光素酶基因的pRL-CMV对照质粒gydF4y2BaRenillagydF4y2BareniformisgydF4y2Ba使用3µl Fugene HD转染试剂(Promega)。根据制造商的方案，使用双荧光素酶报告检测系统(Promega)检测荧光素酶活性，转染48小时后使用CLARIOstar平板阅读器(BMG Labtech)。实验在技术副本中进行。为归一化，萤火虫荧光素酶信号的和除以的和gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba荧光素酶信号。gydF4y2Ba

患者来源的iPSCs的生成和分化gydF4y2Ba

由Helmholtz Zentrum Munchen干细胞研究所的iPSC核心设施从患者和2名对照患者(1和10)的脂肪组织中分离的SVF细胞中生成iPSCs。OCT4、SOX2、LIN28、NANOG染色证实多能性gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba．诱导多能干细胞在Geltrex(赛默飞世尔科学公司)涂层的细胞培养板上，mTeSR 1培养基(干细胞技术公司)，37°C和5% CO下培养gydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

通过定向分化到外胚层，对患者来源的iPSCs的多能性进行了表征gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba,中胚层的gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba和内胚层的gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba如前所述，对每个胚层的标记基因进行qRT-PCR分析gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba．用归一化为β-actin的delta-delta Ct法计算相对表达量。gydF4y2Ba

患者获得的iPSCs和HMGU1对照iPSC系(由Helmholtz Zentrum Munchen干细胞研究所iPSC核心设施提供)按照前面描述的Wang等人的方案分化为HTNs。gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba．为了产生下丘脑npc，每孔50万个iPSCs按照方案中所述在geltrex涂层的12孔板上培养，并在第12天收集。为了进一步分化，每孔30万个单细胞被镀在poly上gydF4y2BalgydF4y2Ba-鸟氨酸- (0.01%，Sigma-Aldrich)和层纤蛋白包被(4µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}；赛默飞世尔科学公司)24孔板。待细胞附着在平板上后，用含B27和10 μM DAPT的N2培养基代替。4 d后，将培养基改为含B27和20 ng ml的N2培养基gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BDNF (R&D)和细胞培养至第26天。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

为了分析ASIP蛋白分泌，将80万个SVF细胞种在15 cm板上，用5µg ml的分泌途径抑制剂孵育24 h后收集细胞和上清液gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}brefeldin A (DMSO;BioLegend)和2µM莫能菌素(70%乙醇;bilegend)或含有相同体积DMSO和乙醇的对照介质。gydF4y2Ba

为了分析融合结构产生的ASIP蛋白，每6孔培养皿中播种60万个HEK细胞，24小时后每孔用8µl Fugene HD转染试剂(Promega)转染2µg质粒。转染24 h后更换培养基。培养基改变48小时后收集细胞和上清液进行免疫印迹。gydF4y2Ba

为了分析iPSC系中ASIP蛋白的生成和分泌，将细胞在六孔板中培养至融合，然后将培养基改为1 ml knockout DMEM，其中含有1× MEM NEAA, 1× β-巯基乙醇，0.1% BSA (Serva)， 100 U青霉素，0.1 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}链霉素和2毫米谷氨酰胺。24 h后，收集细胞和上清液进行免疫印迹。gydF4y2Ba

条件培养基在800℃离心5分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba上清液在HgydF4y2Ba_{2 gydF4y2Ba}O接收10倍浓缩介质。细胞在RIPA裂解缓冲液(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100和0.1% SDS, cOmplete Mini蛋白酶抑制剂鸡尾酒片;Roche, Sigma-Aldrich)，通过QiaShredder均质器柱(QIAGEN)进行额外拆分。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科学公司)测定细胞裂解物的蛋白质浓度。等量的蛋白质或培养基通过12%或15% SDS-PAGE分离，ASIP使用ASIP抗体(PA5-77052, Invitrogen, 1:10 000稀释)检测。用β-肌动蛋白抗体(ab8227, Abcam, 1:10 000稀释)检测β-肌动蛋白，证实负载相等。gydF4y2Ba

cAMP法测定黑素皮质素受体信号gydF4y2Ba

在添加10%胎牛血清的DMEM/F-12中培养中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1 (ATCC cc -61)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}青霉素100µg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}链霉素。细胞以0.9 × 10接种gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba每25厘米的细胞数gydF4y2Ba^{2 gydF4y2Ba}用质粒(3µg DNA总量)和Lipofectamine 2000(赛默飞世尔科学公司)转染。编码人类MC1R的质粒gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba，人类MC4RgydF4y2Ba^62gydF4y2Ba和空矢量pcDps之前已经描述过。gydF4y2Ba

转染1天后，将细胞分裂成96孔板(2 × 10gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}每孔细胞)，实验前血清饥饿16 h。如前所述，采用ALPHAScreen (PerkinElmer)技术，采用非放射性法测定细胞提取物的cAMP含量gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba．简而言之，在转染48小时后，在没有或存在100 nM ASIP (R&D系统)或单独使用不同浓度的ASIP时，使用不同浓度的α-MSH (Sigma-Aldrich)进行刺激。吸吸培养基停止反应，细胞在含1 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的裂解缓冲液20 μl中裂解。每孔5 μl的裂解物转移到384孔板中。受体珠和供体珠是根据制造商的协议添加的。使用GraphPad Prism v.8.4.3分析循环AMP积累数据。gydF4y2Ba

为患有gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba突变gydF4y2Ba

在未选择的队列中gydF4y2BangydF4y2Ba= 1745名莱比锡儿童肥胖队列儿童(平均年龄，11.6岁;女,gydF4y2BangydF4y2Ba= 879;男,gydF4y2BangydF4y2Ba= 867)以及2051名健康人口儿童队列(莱比锡儿童队列，gydF4y2BangydF4y2Ba= 1447;平均年龄11.7岁;女,gydF4y2BangydF4y2Ba= 755;男,gydF4y2BangydF4y2Ba= 692;莱比锡生活方式和环境因素及其对新生儿过敏风险(LINA)队列的影响gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba= 604;平均年龄4岁;女,gydF4y2BangydF4y2Ba= 291;男,gydF4y2BangydF4y2Ba= 313)我们筛选了基因组的携带者gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合。这些研究得到了莱比锡大学伦理委员会(Leipzig childhood cohort, reg)的批准。第007-04/027-04号、782-1998号及029-2006号;LINA队列，注册。编号046-2006及144-10-31052010，在gydF4y2Bahttps://www.birthcohorts.netgydF4y2Ba自2019年5月6日起)。12岁以上的儿童及其监护人提供知情同意。20例肥胖和发色红的患者，他们之前被怀疑是基因突变gydF4y2BaPOMCgydF4y2Ba另外对基因进行基因组筛选gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合。这些患者来自柏林自由大学、柏林洪堡大学、实验儿科内分泌学研究所(平均年龄9.4岁;女,gydF4y2BangydF4y2Ba= 13;男,gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)。该分析得到了当地伦理委员会的批准(EA2/131/11)。gydF4y2Ba

的gDNA拷贝数gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合序列采用SYBR green qRT-PCR，使用Maxima SYBR green /ROX qPCR Master Mix (2×)(赛默飞世尔科学公司)和SYBR green qRT-PCR定量gydF4y2Ba痒gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaASIPgydF4y2Ba融合引物(补充附录和补充表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，每次反应输入2 - 10ng gDNA。拷贝数归一化为β-肌动蛋白拷贝数。在每个盘子上，从病人身上取的样本作为阳性对照。gydF4y2Ba

比较所鉴定携带者的BMI SDS和身高SDSgydF4y2BaASIPgydF4y2Ba我们排除了8例有潜在综合征或内分泌疾病(Prader-Willi综合征、生长激素缺乏、综合征性矮小或自身免疫性多内分泌病)的患者，另有3例患者身高或BMI数据缺失。LINA出生队列中，来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 183先证者、数据和样本仅在出生时可用，因此排除在比较人体测量学分析之外。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

如果没有特别说明，统计分析是使用学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-test(双面)在GraphPad Prism 6 (GraphPad软件)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值<0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba