摘要gydF4y2Ba
补体系统是一个重要的免疫组成部分，但其在肿瘤免疫逃避和CD8中的作用gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞活化还没有明确的定义。在这里，我们证明了表皮生长因子受体(EGFR)/Wnt信号通路诱导β-连环蛋白介导的长非编码RNA (lncRNA) LINC00973表达海绵靶向cd55的miR-216b和靶向cd59的miR-150。CD55/CD59表达的上调抑制了CD8所需的补体系统和细胞因子的分泌gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞活化。CD55/ cd59中和抗体处理或LINC00973启动子突变激活补体和CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，抑制肿瘤生长。重要的是，联合抗cd55 /CD59和抗程序性死亡1(抗pd -1)抗体治疗可引起协同肿瘤抑制作用。此外，CD55/CD59水平与M1巨噬细胞和CD8的浸润呈负相关gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在人类肺癌标本和预测患者预后。这些发现强调了EGFR/Wnt/β-catenin上调CD55/CD59表达在抑制补体和CD8中的关键作用gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞活化用于肿瘤免疫逃避和免疫检查点封锁抵抗，并确定一种潜在的联合治疗来克服这些影响。gydF4y2Ba
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参考文献gydF4y2Ba
李志强，杨志强，杨志强，等。补体:免疫监测和稳态的关键系统。gydF4y2BaImmunol Nat。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba， 785-797(2010)。gydF4y2Ba
李，马斯特洛斯，D. C.， Hajishengallis, G. & Lambris, J. D.补体免疫功能的新见解。gydF4y2BaNat. Rev. Immunol。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba， 503-516(2019)。gydF4y2Ba
补体对癌症患者是好是坏?旧困境的新视角。gydF4y2BaImmunol趋势。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba， 286-292(2009)。gydF4y2Ba
Reis, E. S.， Mastellos, D. C.， Ricklin, D.， Mantovani, A. & Lambris, J. D.癌症中的补体:解开复杂的关系。gydF4y2BaNat. Rev. Immunol。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba， 5-18(2018)。gydF4y2Ba
王志明，王志明，王志明。细胞凋亡加速因子CD55的结构与功能研究。gydF4y2Baj .实验室。中国。地中海。gydF4y2Ba123gydF4y2Ba， 485-491(1994)。gydF4y2Ba
法卡斯等人。CD59不仅阻断C9插入MAC，还抑制同源C5b-8和C5b-9离子通道的形成。gydF4y2Baj .杂志。gydF4y2Ba539gydF4y2Ba， 537-545(2002)。gydF4y2Ba
张荣，刘庆华，廖青，赵艳。CD59是肿瘤免疫治疗的一个有前景的靶点。gydF4y2Ba未来的杂志。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba， 781-791(2018)。gydF4y2Ba
杨晓明，张晓明，张晓明，等。膜结合补体调节蛋白在肿瘤发展和肿瘤免疫治疗中的作用。gydF4y2BaImmunol前面。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba， 1074(2019)。gydF4y2Ba
Garassino, m.c.等人。Durvalumab作为晚期非小细胞肺癌的三线或晚期治疗:一项开放标签、单臂、2期研究gydF4y2Ba柳叶刀杂志。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba， 521-536(2018)。gydF4y2Ba
李，C. K.等。转移性egfr突变非小细胞肺癌中的检查点抑制剂——荟萃分析。gydF4y2Baj . Thorac。肿瘤防治杂志。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba， 403-407(2017)。gydF4y2Ba
卢哲。&亨特，T.泛素化降解活化蛋白激酶。gydF4y2Ba为基础。学生物化学启。gydF4y2Ba78gydF4y2Ba， 435-475(2009)。gydF4y2Ba
吕志勇，姜国强，吕志勇，等。表皮生长因子诱导肿瘤细胞侵袭转移的研究进展。gydF4y2Ba摩尔。细胞。医学杂志。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba， 4016-4031(2001)。gydF4y2Ba
Rösner, T.， Lohse, S.， Peipp, M.， Valerius, T. & Derer, S.表皮生长因子受体靶向IgG3通过替代途径扩增环触发补体介导的衰变加速因子表达肿瘤细胞裂解。gydF4y2Baj . Immunol。gydF4y2Ba193gydF4y2Ba， 1485-1495(2014)。gydF4y2Ba
潘迪，m.k.等。补体驱动戈谢病中葡萄糖神经酰胺积累和组织炎症。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba543gydF4y2Ba， 108-112(2017)。gydF4y2Ba
Ajona, D.等。肺癌细胞中补体因子H的表达:对补体替代通路激活的影响。gydF4y2Ba癌症Res。gydF4y2Ba64gydF4y2Ba， 6310-6318(2004)。gydF4y2Ba
李，C. W.等。程序性死亡配体-1的糖基化和稳定抑制t细胞活性。gydF4y2BaCommun Nat。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba， 12632(2016)。gydF4y2Ba
Du, L.等人-连环蛋白诱导PD-L1转录表达促进胶质母细胞瘤免疫逃避。gydF4y2Ba实验，医学。gydF4y2Ba217gydF4y2Ba， e20191115(2020)。gydF4y2Ba
克鲁梅尔，m.f.等人。整合素对ifn - γ信号的旁分泌共刺激可调节CD8 T细胞分化。gydF4y2Ba国家科学院学报美国gydF4y2Ba115gydF4y2Ba， 11585-11590(2018)。gydF4y2Ba
Bruns, H.等人。抗tnf免疫治疗降低CD8+ T细胞介导的抗结核分枝杆菌活性。gydF4y2Baj .中国。投资。gydF4y2Ba119gydF4y2Ba， 1167-1177(2009)。gydF4y2Ba
武田，K.等。Stat3激活通过防止细胞凋亡负责il -6依赖的T细胞增殖:T细胞特异性Stat3缺陷小鼠的生成和特征。gydF4y2Baj . Immunol。gydF4y2Ba161gydF4y2Ba， 4652-4660(1998)。gydF4y2Ba
卡普拉诺夫等人。阻断il -1 β逆转小鼠乳腺癌中的免疫抑制，并与抗pd -1协同消除肿瘤。gydF4y2Ba国家科学院学报美国gydF4y2Ba116gydF4y2Ba， 1361-1369(2019)。gydF4y2Ba
Tosello Boari, J.等人。il - 17ra信号通路在克氏锥虫感染期间调节CD8+ T细胞存活和衰竭gydF4y2Ba前面。Immunol。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba， 2347(2018)。gydF4y2Ba
Fabian, m.r. & Sonenberg, N. mirna介导的基因沉默机制:miRISC罩下的一看。gydF4y2BaNat。结构。摩尔。杂志。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba， 586-593(2012)。gydF4y2Ba
Jeggari, A.， Marks, D. S. & Larsson, E. miRcode:长非编码转录组中假定的microRNA靶点的地图。gydF4y2Ba生物信息学gydF4y2Ba28gydF4y2Ba， 2062-2063(2012)。gydF4y2Ba
Lan, T.等。LncRNA SNHG10通过正反馈回路调节其同源物SCARNA13促进肝癌发生和转移。gydF4y2Ba癌症Res。gydF4y2Ba79gydF4y2Ba， 3220-3234(2019)。gydF4y2Ba
张，L.等。血清microRNA-150通过靶向抑癌基因SRCIN1预测早期非小细胞肺癌预后，促进肿瘤细胞增殖。gydF4y2Ba中国。杂志。其他。gydF4y2Ba103gydF4y2Ba， 1061-1073(2018)。gydF4y2Ba
Tay, Y.， Rinn, J. & Pandolfi, P. P. ceRNA串扰和竞争的多层复杂性。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba505gydF4y2Ba， 344-352(2014)。gydF4y2Ba
弗斯科，D.等。单个mRNA分子在活的哺乳动物细胞中表现出概率运动。gydF4y2Ba咕咕叫。医学杂志。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba， 161-167(2003)。gydF4y2Ba
他，t.c.等人。鉴定c-MYC为APC通路的靶点。gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba281gydF4y2Ba， 1509-1512(1998)。gydF4y2Ba
Lu, Z.， Ghosh, S.， Wang, Z. & Hunter, T. EGF下调caveolin-1功能导致E-cadherin丢失，β -catenin转录活性增加，肿瘤细胞侵袭增强。gydF4y2Ba癌症细胞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， 499-515(2003)。gydF4y2Ba
Lu, Z. & Hunter, T. wnt独立β -连环蛋白转激活在肿瘤发展中的作用。gydF4y2Ba细胞周期gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba， 571-573(2004)。gydF4y2Ba
杨，W.等。核PKM2调节EGFR激活后β -连环蛋白的转激活。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba480gydF4y2Ba， 118-122(2011)。gydF4y2Ba
Korinek, V.等人。APC-/-结肠癌中β -连环蛋白- tcf复合物的转录激活gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba275gydF4y2Ba， 1784-1787(1997)。gydF4y2Ba
kleinstver, b.p.等人。改变PAM特异性的CRISPR-Cas9核酸酶。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba523gydF4y2Ba， 481-485(2015)。gydF4y2Ba
默里，S.等人。非小细胞肺癌中表皮生长因子受体酪氨酸激酶结构域和酪氨酸激酶抑制剂对TKIs反应的体细胞突变:一个分析数据库。gydF4y2Baj . Thorac。肿瘤防治杂志。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba， 832-839(2008)。gydF4y2Ba
Nusse, R. & Clevers, H. Wnt/ β -连环蛋白信号，疾病和新兴治疗方式。gydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba169gydF4y2Ba， 985-999(2017)。gydF4y2Ba
Tammela, T.等。产生wnt的生态位驱动肺腺癌的增殖潜能和进展。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba545gydF4y2Ba， 355-359(2017)。gydF4y2Ba
Rossignol, A.， Bonnaudet, V.， Clemenceau, B.， Vie, H. & Bretaudeau, L.一种用于测量细胞毒性的高性能、非放射性效力测定法:完全替代针对法规符合性目标的铬释放测定法。gydF4y2Ba马伯gydF4y2Ba9gydF4y2Ba， 521-535(2017)。gydF4y2Ba
Mantovani, A.， Marchesi, F.， Malesci, A.， Laghi, L. & Allavena, P.肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤学治疗靶点。gydF4y2BaNat. Rev. clinin。肿瘤防治杂志。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba， 399-416(2017)。gydF4y2Ba
Kolev, M, Le Friec, G. & Kemper, C.互补挖掘新位点和效应器系统。gydF4y2BaNat. Rev. Immunol。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba， 811-820(2014)。gydF4y2Ba
Mezquita, L.等人。晚期非小细胞肺癌患者肺免疫预后指数与免疫检查点抑制剂结果的相关性gydF4y2BaJAMA杂志。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， 351-357(2018)。gydF4y2Ba
赫尔曼博士等人。Nivolumab联合ipilimumab治疗肿瘤突变负担高的肺癌。gydF4y2Ba新英格兰。j .地中海。gydF4y2Ba378gydF4y2Ba， 2093-2104(2018)。gydF4y2Ba
王，W.等。评价AXIN1和AXIN2在肝细胞癌细胞系中作为坦克酸酶抑制靶点的作用。gydF4y2Ba科学。代表。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba， 7470(2021)。gydF4y2Ba
Biswas, S. K. & Mantovani, a .巨噬细胞可塑性和与淋巴细胞亚群的相互作用:癌症作为一个范例。gydF4y2BaImmunol Nat。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba， 889-896(2010)。gydF4y2Ba
姚艳，徐晓华，金丽丽。巨噬细胞极化与生理性妊娠的关系。gydF4y2Ba前面。Immunol。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba， 792(2019)。gydF4y2Ba
Mitsi, E.等人。人肺泡巨噬细胞主要稳定表达经典M1和M2表面标记物。gydF4y2Ba和。Res。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba， 66(2018)。gydF4y2Ba
高，S.等。新辅助PD-1抑制剂(sintilimab)在NSCLC中的应用。gydF4y2Baj . Thorac。肿瘤防治杂志。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba， 816-826(2020)。gydF4y2Ba
Shukuya, T.等人。抗pd -1/PD-L1抗体治疗晚期非小细胞肺癌患者的总生存期与缓解期或无进展生存期的关系gydF4y2Baj . Thorac。肿瘤防治杂志。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba， 1927-1939(2016)。gydF4y2Ba
盖纳，J. F.等。EGFR突变和ALK重排与非小细胞肺癌中PD-1通路阻断的低反应率相关:一项回顾性分析gydF4y2Ba中国。癌症Res。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba， 4585-4593(2016)。gydF4y2Ba
Pio, R, Ajona, D, ortizz - espinosa, S, Mantovani, A. & Lambris, J. D.补充癌症免疫周期。gydF4y2Ba前面。Immunol。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba， 774(2019)。gydF4y2Ba
Mamidi, S. Hone, S. & Kirschfink, M.癌症中的补体系统:肿瘤破坏和促进之间的矛盾。gydF4y2Ba免疫生物学gydF4y2Ba222gydF4y2Ba， 45-54(2017)。gydF4y2Ba
麦德勒，T. R.等人。补体C5a促进鳞状癌的发生并限制T细胞对化疗的反应。gydF4y2Ba癌症细胞gydF4y2Ba34gydF4y2Ba， 561-578 e566(2018)。gydF4y2Ba
Ajona, D.等。PD-1/C5a联合阻断剂协同保护肺癌生长和转移。gydF4y2Ba癌症。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba， 694-703(2017)。gydF4y2Ba
Markiewski, m.m.等人。补体对抗肿瘤免疫反应的调节。gydF4y2BaImmunol Nat。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba， 1225-1235(2008)。gydF4y2Ba
郭，J. W.等。通过C3a受体通路的补体激活改变CD4(+) T淋巴细胞并介导肺癌进展。gydF4y2Ba癌症Res。gydF4y2Ba78gydF4y2Ba， 143-156(2018)。gydF4y2Ba
Ajona, D.等。补体活化产物c4d作为肺癌诊断和预后生物标志物的研究。gydF4y2Ba国立肿瘤研究所。gydF4y2Ba105gydF4y2Ba， 1385-1393(2013)。gydF4y2Ba
王毅，等。自分泌补体抑制il10依赖的t细胞介导的抗肿瘤免疫，促进肿瘤进展。gydF4y2Ba癌症。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba， 1022-1035(2016)。gydF4y2Ba
补体系统在癌症中的作用。gydF4y2Baj .中国。投资。gydF4y2Ba127gydF4y2Ba， 780-789(2017)。gydF4y2Ba
Aykut, B.等人。真菌菌群通过激活MBL促进胰腺肿瘤的发生。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba574gydF4y2Ba， 264-267(2019)。gydF4y2Ba
徐，D.等。糖异生酶PCK1磷酸化INSIG1/2进行脂肪生成。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba580gydF4y2Ba， 530-535(2020)。gydF4y2Ba
Lu, Z.等。蛋白激酶C的激活触发其泛素化和降解。gydF4y2Ba摩尔。细胞。医学杂志。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba， 839-845(1998)。gydF4y2Ba
Soe, M. J.， Moller, T.， Dufva, M. & Holmstrom, K.使用2 ' - o -甲基RNA+LNA探针进行microRNA原位杂交的敏感替代。gydF4y2Baj . Histochem。Cytochem。gydF4y2Ba59gydF4y2Ba， 661-672(2011)。gydF4y2Ba
王，W.等。METTL3通过APC mRNA N(6)-甲基腺苷依赖YTHDF结合介导的降低APC表达促进肿瘤发展。gydF4y2BaCommun Nat。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba， 3803(2021)。gydF4y2Ba
哈斯，B. J.等。利用Trinity平台从RNA-seq中重建转录本序列，用于参考生成和分析。gydF4y2BaProtoc Nat。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba， 1494-1512(2013)。gydF4y2Ba
Xia, Y. et al.通过hdac3依赖性转录抑制下调c-Jun促进渗透胁迫诱导的细胞凋亡。gydF4y2Ba摩尔。细胞gydF4y2Ba25gydF4y2Ba， 219-232(2007)。gydF4y2Ba
李，X.等。线粒体易位PGK1作为蛋白激酶在肿瘤发生过程中协调糖酵解和TCA循环。gydF4y2Ba摩尔。细胞gydF4y2Ba61gydF4y2Ba， 705-719(2016)。gydF4y2Ba
van der Maten, E.， de Jonge, M. I.， de Groot, R.， van der Flier, M. & Langereis, J. D.在水蛭素抗凝全血中确定有助于调理吞噬细胞杀灭的细菌和宿主因素的通用试验。gydF4y2Ba科学。代表。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba， 42137(2017)。gydF4y2Ba
Cattaneo, c.m.等人。肿瘤有机- t细胞共培养系统。gydF4y2BaProtoc Nat。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba， 15-39(2020)。gydF4y2Ba
Barkal, a.a.等人。CD24信号通过巨噬细胞Siglec-10是癌症免疫治疗的一个靶点。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba572gydF4y2Ba， 392-396(2019)。gydF4y2Ba
伊藤等人。通过人IL-33/IL-13轴研究哮喘气道炎症的人源化小鼠模型。gydF4y2Ba江森自控的洞察力gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba， e121580(2018)。gydF4y2Ba
佐藤，F.等。补体依赖的细胞毒性增强抗cd20抗体介导人源化NOD/Shi-scid, IL-2Rgamma(null)小鼠淋巴瘤模型中强大的抗肿瘤活性。gydF4y2Ba癌症Immunol。Immunother。gydF4y2Ba59gydF4y2Ba， 1791-1800(2010)。gydF4y2Ba
艾森豪尔，e.a.等。实体肿瘤的新反应评价标准:修订的RECIST指南(1.1版)。gydF4y2Ba欧元。j .癌症gydF4y2Ba45gydF4y2Ba， 228-247(2009)。gydF4y2Ba
第八版TNM肺癌分期分类:它对主流社会意味着什么?gydF4y2Baj . Thorac。Cardiovasc。杂志。gydF4y2Ba155gydF4y2Ba， 356-359(2018)。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
国家重点研发计划项目(no. 2020YFA0803300, no. 2020AAA0109500, no. Z.L.， no. 82188102, no. 82030074, no. 82122053, no. 32100574);浙江大学科研基金资助项目(no. LD21H160003);浙江省创新创业领军人才引进计划(批准号:188020*194221901/029);2019R01001转z.l)，北京市科学技术委员会(批准号:2010r01001);Z191100006619115资助北京市教委科研发展计划项目(批准号:Z191100006619115);KJZD20191002302至J.H.)， CAMS创新医学计划(批准号:KJZD20191002302)。2021- i2m -1- 012,2021 - i2m -1-015 to J.H.)，爱友基金(批准号:;中国医学科学院非营利性中央研究所基金项目(批准号:KY201701至J.H.);广东省重点领域研究发展计划项目(批准号:2021-PT310-001);2021B0101420005至Y.G.)和山东省自然科学基金项目(批准号:; ZR2020QH191 to F.S.). Z.L. is the Kuancheng Wang Distinguished Chair.
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
z.l构思并设计了这项研究，并撰写了手稿。郑志良、j.h.、Y.G.和F.S.获得资助并监督研究。F.S.进行了大部分实验。f.s.， Y.G.和W.W.为产生各种敲入突变细胞系和稳定转染细胞系提供了支持。X.G.和D.G.为IHC染色提供了支持。H.H.和L.X.参与了对小鼠的研究。Y.X.和D.G.对数据进行了统计分析。J.H.提供NSCLC样本和技术支持。Z.L、j.h.、y.g.、J.F.和F.S.审阅并编辑了手稿。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
同行评审gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba
自然癌症gydF4y2Ba感谢Maite Huarte、Lubka Roumenina和Tuomas Tammela对本工作的同行评审所作的贡献。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展数据gydF4y2Ba
图1 EGFR激活增加CD55和CD59的表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， H322M细胞分别加入或不加入EGF (100 ng/ml)处理24 h。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba抵扣gydF4y2Ba用EGF (100 ng/ml)处理或不处理抗CD55和/或CD59 shRNAs的H322M细胞24 h。将细胞在DMEM (10% FBS)培养液中加入25% v/v人血清和25 μg/ml赖皮芦丁孵育3 h。gydF4y2BabgydF4y2Ba、用指定抗体流式细胞仪检测肿瘤细胞表面C3b、C5b-9表达的代表性结果。gydF4y2BacgydF4y2Ba采用流式细胞仪检测C3b、C5b-9在肿瘤细胞表面的表达。gydF4y2BadgydF4y2Ba，采用ELISA法测定上清中过敏性毒素(C3a和C5a)的含量。gydF4y2BaegydF4y2Ba，指示细胞与人pbmc共培养。检测相应细胞因子在培养基中的表达。gydF4y2BafgydF4y2Ba， H1395细胞分别加入或不加入EGF (100 ng/ml)处理12 h。的相对表达量gydF4y2BaCFHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba循环流化床gydF4y2Ba，gydF4y2BaC3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaC5gydF4y2Ba用qPCR检测mrna。gydF4y2BaggydF4y2Ba， H1395细胞分别加入或不加入EGF (100 ng/ml)处理12 h。检测细胞培养上清中因子H、因子B、因子C3、因子C5的表达水平。gydF4y2BahgydF4y2Ba用EGF (100 ng/ml)处理或不加EGF处理H1395细胞24 h，然后用DMEM (10% FBS) + 25% v/v人血清和25 μg/ml lepirudin孵育3 h。然后将这些细胞与人pbmc共培养。颗粒酶B和穿孔素在CD8中的表达水平gydF4y2Ba+gydF4y2Ba用相应抗体流式细胞术检测T细胞。给出了具有代表性的结果。gydF4y2BaC d e f ggydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's t检验进行分析。gydF4y2BangydF4y2Ba= 6个生物独立的重复gydF4y2Ba(c d f g)gydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba= 7名人类捐献者gydF4y2Ba(e)gydF4y2Ba．HS，人血清。gydF4y2Ba
图2 EGFR通过抑制miR-216b/miR-150上调CD55/CD59。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba的启动子驱动的荧光素酶报告基因gydF4y2BaCD55gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCD59gydF4y2Ba与表达EGFR的载体共转染293 T细胞。细胞分别用EGF (100 ng/ml)或不加EGF处理8小时。测定荧光素酶活性。相对荧光素酶活性归一化至无EGF组。gydF4y2BabgydF4y2Ba, H1395gydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba或H322MgydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba用EGF (100 ng/ml)或不加EGF处理细胞12 h。的转录内含子的相对RNA表达水平gydF4y2BaCD55gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCD59gydF4y2Ba用qPCR法检测基因。gydF4y2Bad-fgydF4y2Ba所示细胞表达两种不同的小干扰rna (siRNAs)中的一种gydF4y2Ba小礼帽gydF4y2Ba(d)gydF4y2Ba然后加入或不加入EGF (100 ng/ml) 24小时gydF4y2Ba(e, f)gydF4y2Ba．免疫印迹gydF4y2Ba(e)gydF4y2Ba和qPCRgydF4y2Ba(f)gydF4y2Ba进行分析。使用指定抗体进行免疫印迹分析gydF4y2Ba(d, e)gydF4y2Ba．gydF4y2BaggydF4y2Ba， miRNA码预测算法(gydF4y2Bahttp://www.mircode.org/index.phpgydF4y2Ba)预测的miRNAs及其靶序列gydF4y2BaCD55gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCD59gydF4y2Ba显示mRNAs。gydF4y2Bah,我gydF4y2Ba表达荧光素酶报告基因的H322M细胞融合或不融合WT 3 ' UTRs或相应的突变体(MUT)gydF4y2BaCD55gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCD59gydF4y2Ba用miR-Control、miR-150-mimics或miR-216b-mimics转染基因gydF4y2Ba(h)gydF4y2Ba或使用miR-Control、mir -150 inhibitor或mir -216b inhibitorgydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba．在没有融合3 ' UTRs的荧光素酶报告基因表达的细胞中，相对荧光素酶活性归一化至miR-Control组。gydF4y2Baj-mgydF4y2Ba，表达miR-Control, mir -150 mimics或mir -216b mimics的H322M细胞gydF4y2Ba(j, k)gydF4y2Ba或表达miR-Control、mir -150 inhibitor或mir -216b inhibitorgydF4y2Ba(l, m)gydF4y2Ba加入或不加入EGF (100 ng/ml) 12 hgydF4y2Ba(j l)gydF4y2Ba或24小时gydF4y2Ba(k,米)gydF4y2Ba．qPCRgydF4y2Ba(j l)gydF4y2Ba和免疫印迹gydF4y2Ba(k,米)gydF4y2Ba进行分析。使用指定抗体进行免疫印迹分析gydF4y2Ba(k,米)gydF4y2Ba．gydF4y2Ban, ogydF4y2BaH1395和H322M细胞分别用EGF (100 ng/ml)和不加EGF处理24 h。进行免疫印迹分析gydF4y2Ba(n)gydF4y2Ba和量化gydF4y2Ba(o)gydF4y2Ba．使用指定抗体进行免疫印迹分析gydF4y2Ba(n)gydF4y2Ba．gydF4y2BaA-c f h-j l ogydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BangydF4y2Ba= 6gydF4y2Ba(a, c, f, h-j, l)gydF4y2Ba或4gydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba或3gydF4y2Ba(o)gydF4y2Ba生物独立复制。gydF4y2Ba
图3 EGFR上调LINC00973至海绵miR-216b和miR-150。gydF4y2Ba
a、bgydF4y2Ba， lncRNA LINC00973上miR-216b和miR-150结合位点示意图。gydF4y2BacgydF4y2BaLINC00973的5 '和3 '序列是用RACE方法得到的。从LINC00973的5’和3’序列扩增出的PCR产物以及从Ensembl Genome Browser中获得的LINC00973序列的已知区域在琼脂糖凝胶上分离。根据PCR产物的测序结果显示序列大小。有代表性的凝胶电泳反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验。gydF4y2BadgydF4y2BaRACE中LINC00973引物得到的PCR产物进行测序。这个新发现的全长序列gydF4y2BaLINC00973gydF4y2Ba与gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba的rna -seq组装转录本序列gydF4y2BaLINC00973gydF4y2BaH1395细胞和人类的ensemble - annotation转录本序列gydF4y2BaLINC00973gydF4y2Ba．gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba的基因组位置所映射的reads的组装gydF4y2BaLINC00973gydF4y2Ba从RNA-seq数据(SRA登录号:gydF4y2BaPRJNA847056gydF4y2Ba)的H1395细胞。gydF4y2BafgydF4y2Ba，用GEPIA检测LINC00973的表达水平。箱形图元素定义为:延伸至第25至75百分位的箱形图元素;须延伸最小值到最大值;中间值由横线表示。gydF4y2BangydF4y2Ba= 483个肿瘤组织;gydF4y2BangydF4y2Ba= 347个正常组织。LUAD，肺腺癌;TPM，百万分抄本;T,肿瘤;N,正常;Num，样本数量。gydF4y2BaggydF4y2Ba制备H322M细胞总裂解液、胞浆和核组分。RNA被纯化。的相对表达量gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba(细胞质控制)，gydF4y2BaRNU6-1gydF4y2Ba(核控制)和gydF4y2BaLINC00973gydF4y2Ba采用qPCR检测rna。gydF4y2BahgydF4y2Ba， H322M细胞分别用EGF (100 ng/ml)或不加EGF (100 ng/ml)处理。进行qPCR。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，抗gfp抗体用于检测内源性与LINC00973相关的miRNAs的RIP图。gydF4y2BaJ l mgydF4y2Ba， MS2-GFP与MS12或指定的MS12- lncrna共转染H322M细胞。通过GFP-RIP和随后的microRNA qRT-PCR检测lncrna相关的microRNA。gydF4y2BakgydF4y2Ba， LINC00973上miR-216b和miR-150结合位点突变的示意图。gydF4y2Ba阻燃剂gydF4y2Ba， H322M细胞转染生物素偶联的lncRNA，然后链霉亲和素拉下试验和随后的microRNA qRT-PCR检测相关的内源性microRNA。gydF4y2BaG h j l-pgydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BangydF4y2Ba= 6个生物独立的重复。gydF4y2Ba
图4 EGFR增加LINC00973到海绵miR-216b和miR-150。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba表达荧光素酶报告基因的H1395和H322M细胞经miR-Control、miR-150-mimics或miR-216b-mimics转染后，与LINC00973的前200个5 '核苷酸融合(含或不含miR-216b或miR-150结合序列突变)。荧光素酶的相对活性显示。gydF4y2Bab, cgydF4y2BaH1395和H322M细胞分别转染miR-Control、miR-150-mimics或miR-216b-mimics。的相对表达量gydF4y2BaLINC00973gydF4y2Ba采用qPCR检测RNAgydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba．使用抗Ago2抗体的RIP和随后的lncRNA qRT-PCR检测指示的microrna相关的lncRNAgydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba．gydF4y2Bad、egydF4y2Ba分别转染H1395、H322M细胞。的相对表达量gydF4y2BaLINC00973 lncrna - 225205gydF4y2BarnagydF4y2Ba(d)gydF4y2Ba， miR-216b或miR-150 miRNAsgydF4y2Ba(e)gydF4y2Ba采用qPCR检测。gydF4y2Baf, ggydF4y2BaH1395和H322M细胞分别用EGF (100 ng/ml)和不加EGF处理12 hgydF4y2Ba(f)gydF4y2Ba或者指定的时间gydF4y2Ba(g)gydF4y2Ba．从细胞中提取总RNA。用qPCR定量LINC00973、miR-216b和miR-150在指示细胞中的拷贝数。计算了LINC00973与miR-216b和miR-150结合的化学计量学。代表性的化学计量关系反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验。gydF4y2Ba(g)gydF4y2Ba．gydF4y2Bah,我gydF4y2BaH1395和H322M细胞稳定转染或不转染LINC00973 shRNAs。细胞用EGF (100 ng/ml)处理或不处理12gydF4y2Ba(h)gydF4y2Ba或24小时gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba．qPCRgydF4y2Ba(h)gydF4y2Ba免疫印迹分析gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba被执行。gydF4y2Baj, kgydF4y2Ba，在LINC00973上显示miR-216-和mir -150结合元件(miR-216b/150-BE)的示意图。从亲本H1395中提取基因组DNA (gydF4y2BajgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BakgydF4y2Ba)和两个H1395的克隆(gydF4y2BajgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BakgydF4y2Ba) miR-216b/150-BE基因敲入突变的细胞。PCR产物从指示的DNA片段扩增，并在琼脂糖凝胶上分离。有代表性的凝胶电泳反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验。亲本H1395的测序数据(gydF4y2BajgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BakgydF4y2Ba)及两个H1395的克隆个体(gydF4y2BajgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BakgydF4y2Ba)显示miR-216b/150-BE基因敲入突变的细胞。带箭头和不带箭头的红线分别表示sgrna靶向序列和PAM。蓝色箭头表示突变的核苷酸。带或不带突变核苷酸的miR-216b/150-BE的位置用实红色框表示。将所示核苷酸的沉默突变引入序列中，以避免Cas9重复切割。gydF4y2BalgydF4y2Ba，相对mRNAgydF4y2Ba(左)gydF4y2Ba和蛋白质gydF4y2Ba(m)gydF4y2Ba水平的gydF4y2BaCD55gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCD59gydF4y2Ba分别用qPCR和免疫印迹分析检测所示细胞中的mrna。gydF4y2BaA-f h lgydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BangydF4y2Ba= 6个生物独立的重复。WT，野生型;C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2Ba
图5 EGFR/ wnt激活β-catenin增强LINC00973的表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，显示三种潜在LEF/ tcf结合元件(tbe;CTTTG(A/T)(A/T))在启动子区gydF4y2BaLINC00973gydF4y2Ba．gydF4y2Bab, cgydF4y2Ba，从亲本H1395中提取基因组DNA (gydF4y2BabgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BacgydF4y2Ba)和两个H1395的克隆(gydF4y2BabgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BacgydF4y2Ba)在三个tbe中出现敲入突变(AT到GC)。PCR产物从指示的DNA片段中扩增，并在琼脂糖凝胶上分离。有代表性的凝胶电泳反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验。亲本H1395的测序数据(gydF4y2BabgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BacgydF4y2Ba)和两个H1395的克隆(gydF4y2BabgydF4y2Ba)及H322M (gydF4y2BacgydF4y2Ba)在三个tbe中显示了敲入突变(AT到GC)的细胞。带箭头和不带箭头的红线分别表示sgrna靶向序列和PAM。黑色箭头表示突变的核苷酸。三种有或没有突变核苷酸的tbe用实红色框表示。将所示核苷酸的沉默突变引入序列中，以避免Cas9重复切割。gydF4y2BadgydF4y2Ba，亲本H1395和H322M细胞以及LINC00973 TBE敲入突变的指示克隆(AT到GC)用EGF刺激或不刺激12 h。进行qPCR。gydF4y2Bae, fgydF4y2Ba，有或没有β-catenin shRNA表达、重组rβ-catenin表达或miR-216b inhibitor表达的H322M细胞gydF4y2Ba(e)gydF4y2Ba或miR-150抑制剂gydF4y2Ba(f)gydF4y2Ba加入或不加入EGF处理24 h。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Bag hgydF4y2Ba在miR-216b抑制剂存在或不存在的情况下，表达LINC00973 shRNA#1或LINC00973 shRNA#2的H322M细胞gydF4y2Ba(g)gydF4y2Ba或miR-150抑制剂gydF4y2Ba(h)gydF4y2Ba加入或不加入EGF处理24 h。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，亲本H1395和H322M细胞以及LINC00973 TBE敲入突变的指示克隆用EGF刺激或不刺激24 h。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Baj, kgydF4y2Ba，有或没有LINC00973 TBE2敲入突变和/或miR-216b抑制剂表达的亲本H1395或H322M细胞gydF4y2Ba(j)gydF4y2Ba或mir - 150gydF4y2Ba(k)gydF4y2Ba加入或不加入EGF (100 ng/ml) 24 h。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Bal-ngydF4y2Ba， H1395或H322M细胞，EGFR L858R表达或不表达gydF4y2Ba(l-n)gydF4y2Ba， TBE2敲入突变，β-catenin shRNA, rβ-catenin, LINC00973 shRNAgydF4y2Ba(左)gydF4y2Ba， miR-216b模拟gydF4y2Ba(m)gydF4y2Ba，或miR-150模拟物gydF4y2Ba(n)gydF4y2Ba进行了分析。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Bao rgydF4y2Ba，用Wnt-7B或Wnt-5A (200 ng/ml)处理或不加处理H1395细胞12 h。进行qPCR。gydF4y2BapgydF4y2Ba，指示的相对mRNA水平gydF4y2BaFzdgydF4y2Ba用qPCR法检测H1395细胞中受体、LRP5和LRP6的表达。gydF4y2Ba问gydF4y2Ba，卷曲6 shRNA在H1395细胞中表达。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2BaD o p rgydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及gydF4y2Ba(d, o, r)gydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba= 6gydF4y2Ba阿,(d)gydF4y2Ba或4gydF4y2Ba(p, r)gydF4y2Ba生物独立复制。gydF4y2BaB-d i-k ogydF4y2Ba， WT，野生型;C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2Ba
图6 EGFR-β-catenin-LINC00973-miR-216b/150轴抑制补体。gydF4y2Ba
得了gydF4y2Ba用EGF刺激或不刺激表达β-catenin shRNA或LINC00973 TBE2敲入突变的H322M细胞24 h。流式细胞术检测肿瘤细胞表面C3b、C5b-9的表达gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba．采用ELISA法测定上清中过敏性毒素(C3a、C5a)含量gydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba．指示细胞与人pbmc共培养。ELISA法检测细胞因子的表达gydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba．gydF4y2Bad-fgydF4y2Ba, H322MgydF4y2Ba(d-f)gydF4y2Ba或H1395gydF4y2Ba(d, e)gydF4y2Ba表达miR或shrna对抗CD55和CD59的细胞用或不用EGF (100 ng/ml)处理24小时。流式细胞术检测肿瘤细胞表面C3b、C5b-9的表达gydF4y2Ba(d)gydF4y2Ba．采用ELISA法测定上清中过敏性毒素(C3a、C5a)含量gydF4y2Ba(e)gydF4y2Ba．指示细胞与人pbmc共培养。ELISA法检测细胞因子的表达gydF4y2Ba(f)gydF4y2Ba．gydF4y2Bag-lgydF4y2Baβ-catenin shRNA表达或不表达H1395或l858r的H1395细胞gydF4y2Ba(胃肠道)gydF4y2Ba， LINC00973 TBE2基因敲入突变gydF4y2Ba(g-l)gydF4y2Ba，抗CD55和CD59的shRNAs，或miR-216b/miR-150抑制剂gydF4y2Ba(j-l)gydF4y2Ba用流式细胞术检测C3b和C5b-9的表达gydF4y2Ba(g j)gydF4y2Ba， C3a和C5agydF4y2Ba(h, k)gydF4y2Ba，与人pbmc共培养后的细胞因子gydF4y2Ba(我左)gydF4y2Ba通过ELISA。gydF4y2BalgydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BangydF4y2Ba= 6个生物独立的重复gydF4y2Ba(a, b, d, e, g, h, j, k)gydF4y2Ba或者7个人类捐献者gydF4y2Ba(c, f, i, l)gydF4y2Ba．C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2Ba
图7 EGFR/β-catenin增强CD55/CD59抑制免疫细胞功能gydF4y2Ba
模拟gydF4y2Ba在H322M细胞中表达或不表达纳米荧光素酶gydF4y2Ba(a, c)gydF4y2Ba， β-连环蛋白shRNA, LINC00973 TBE2敲入突变gydF4y2Ba(a, b)gydF4y2Ba， miR-216b模拟物，miR-150模拟物，miR-216b抑制剂，miR-150抑制剂，或靶向CD55和CD59的shRNAsgydF4y2Ba(c, d)gydF4y2Ba用EGF刺激或不使用EGF刺激24小时，然后与人pbmc共培养。使用纳米荧光酶释放法对特异性裂解进行CARIA分析gydF4y2Ba(a, c)gydF4y2Ba．进行MTS测定gydF4y2Ba(b, d)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba超高频gydF4y2Ba表达H1395和EGFR l858r的H1395细胞，无论是否表达纳米荧光素酶gydF4y2Ba(e, g)gydF4y2Ba， β-连环蛋白shRNAgydF4y2Ba(e, f)gydF4y2Ba， LINC00973 TBE2基因敲入突变gydF4y2Ba(情况)gydF4y2Ba，抗CD55和CD59的shRNAs，或miR-216b/miR-150抑制剂gydF4y2Ba(g h)gydF4y2Ba与人类pbmc共培养。使用纳米荧光酶释放法对特异性裂解进行CARIA分析gydF4y2Ba(e, g)gydF4y2Ba．进行MTS测定gydF4y2Ba(f、h)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， M0、M1、M2巨噬细胞对H1395、H322M细胞的归一化吞噬率。gydF4y2Baj-mgydF4y2Ba, H322MgydF4y2Ba(j, k)gydF4y2Ba表达EGFR l858r的H1395细胞gydF4y2Ba(l, m)gydF4y2Ba伴有或不伴有β-catenin shRNA表达gydF4y2Ba(j l)gydF4y2Ba， LINC00973 TBE2基因敲入突变gydF4y2Ba(j, l, m)gydF4y2Ba， miR-216b模拟物，miR-150模拟物，miR-216b抑制剂，miR-150抑制剂，或靶向CD55和CD59的shRNAsgydF4y2Ba(k,米)gydF4y2Ba以EGF (100 ng/ml)刺激或不以EGF刺激24 h。测定肿瘤细胞的正常吞噬率gydF4y2Ba(j-m)gydF4y2Ba．用抗cd11b抗体进行流式细胞仪检测。FITC，异硫氰酸荧光素gydF4y2Ba(左面板)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba阻燃剂gydF4y2BaH1395和表达EGFR l858r的H1395细胞gydF4y2Ba(n, o)gydF4y2Ba或H322M细胞gydF4y2Ba(p)gydF4y2BaLINC00973 TBE2基因敲入突变gydF4y2Ba(氮、磷)gydF4y2Ba， mir -216b mimics和mir -150 mimicsgydF4y2Ba(o)gydF4y2Ba，或CD55/CD59 shRNAsgydF4y2Ba(p)gydF4y2Ba与人类pbmc共培养。颗粒酶B和穿孔素在CD8中的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba采用流式细胞术检测T细胞gydF4y2Ba(n, o)gydF4y2Ba．指示细胞与人pmcs在含或不含抗cd8单克隆抗体的培养基中共培养30小时。进行MTS测定gydF4y2Ba(p)gydF4y2Ba．gydF4y2BapgydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BangydF4y2Ba= 7gydF4y2Ba(a -阻燃剂)gydF4y2Ba或4gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba或6gydF4y2Ba(j-m)gydF4y2Ba人类的捐助者。C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2Ba
图8 CD55/CD59通过抑制补体促进肿瘤生长。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaMLINC00973的5 '和3 '序列用RACE方法得到。从MLINC00973的5 '和3 '序列扩增出的PCR产物和已知区域gydF4y2BaMLINC00973gydF4y2Ba来自国家生物技术信息中心数据库的序列在琼脂糖凝胶上分离。根据PCR产物的测序结果显示序列大小。有代表性的凝胶电泳反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验。米,标志;L1, 1车道。gydF4y2BabgydF4y2Ba利用RACE方法获得了MLINC00973的全序列。对MLINC00973 5 '和3 '序列引物PCR产物进行测序。gydF4y2BacgydF4y2Ba， LEF/ tcf结合元件示意图(TBE;MLINC00973启动子中的CTTTG(A/T)(A/T)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，从两个tbe中具有敲入突变(AT到GC或AA到GG，如所示)的LA795细胞的两个单个克隆中提取基因组DNA。PCR产物从指示的DNA片段扩增，并在琼脂糖凝胶上分离。有代表性的凝胶电泳反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验。C1，克隆1;C2，克隆2。亲本细胞和两个单独的敲入突变克隆的序列显示。带箭头的红线表示sgrna靶向序列。没有箭头的红线表示原间隔相邻基序(PAM)。两个有或没有突变核苷酸的tbe用实红色框表示。将所示核苷酸的沉默突变引入序列中，以避免Cas9重复切割。gydF4y2BaegydF4y2Ba采用qPCR方法检测MLINC00973 TBE敲入突变或EGFR L858R表达LA795细胞中MLINC00973的相对RNA水平。数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2BangydF4y2Ba= 6个生物独立的重复。C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2BafgydF4y2Ba， MLINC00973上mmu-miR-216b和mmu-miR-150结合位点的示意图。gydF4y2Bag hgydF4y2Ba，有或没有EGFR L858R表达的LA795细胞经miR-Control、mmu-miR-216b或mmu-miR-150稳定转染gydF4y2Ba(g)gydF4y2Ba， β-catenin shRNA, rβ-catenin，或mmu-miR-216b/mmu-miR-150海绵gydF4y2Ba(h)gydF4y2Ba．使用指定抗体进行免疫印迹分析。C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，有或没有MLINC00973 TBE敲入突变的LA795细胞用EGFR L858R和/或mmu-miR-216b/mmu-miR-150海绵转染。使用指定抗体进行免疫印迹分析。C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2Ba
图9 CD55/CD59通过抑制补体加速肿瘤生长。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，用所示抗体进行免疫荧光分析。具有代表性的免疫荧光图像反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验。gydF4y2Ba抵扣gydF4y2BaL858R在存在或不存在EGFR表达情况下，LA795细胞均表达GFPgydF4y2BaMLINC00973gydF4y2Ba将敲入TBE4突变体或CD55/CD59 shRNA表达的小鼠皮下注射到具有免疫能力的“615”小鼠体内。注射后23天切除肿瘤。将切碎的肿瘤组织均质化。过敏性毒素(C3a和C5a)释放gydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba以及细胞因子蛋白水平gydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba采用酶联免疫吸附法测定肿瘤微环境(TME)。典型的流式细胞仪图显示TAM在所示肿瘤中有吞噬作用。数字表示所有tam归一化吞噬事件的频率gydF4y2Ba(d)gydF4y2Ba．代表性结果显示肿瘤浸润CD8中颗粒酶B和穿孔素表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba(e)gydF4y2Ba．gydF4y2Baf-ngydF4y2BaL858R在存在或不存在EGFR表达情况下，LA795细胞均表达GFPgydF4y2BaMLINC00973gydF4y2Ba将敲入TBE4突变体或mmu-miR-216b/mmu-miR-150海绵皮下注射到具有免疫功能的同基因“615”小鼠中。注射后23天切除肿瘤。gydF4y2BafgydF4y2Ba，测量肿瘤体积和重量。对肿瘤体积进行纵向分析;gydF4y2BangydF4y2Ba= 6只老鼠(左)。数据采用双侧未配对Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及;gydF4y2BangydF4y2Ba= 6只老鼠(右)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，采用Kaplan-Meier图分析小鼠存活率。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值计算使用agydF4y2Balog-rankgydF4y2Ba测试(两面)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 10只老鼠。gydF4y2BahgydF4y2Ba使用指定抗体和探针对肿瘤进行免疫组化和ISH分析。展示代表性图像。红色框内的区域是在放大倍数下显示的。用非参数检验分析各组间表达差异的显著性。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，从切碎的肿瘤片中获得单细胞悬液。流式细胞术分离表达GFP的肿瘤细胞。流式细胞术检测肿瘤细胞表面C3b和C5b-9的表达。gydF4y2Baj-lgydF4y2Ba，将切碎的肿瘤组织均质，调整至10 mg/ml。过敏性毒素(C3a和C5a)释放gydF4y2Ba(j)gydF4y2Ba以及细胞因子蛋白水平gydF4y2Ba(k)gydF4y2Ba采用ELISA法测定TME。使用纳米荧光酶释放法进行特异性裂解CARIA试验gydF4y2Ba(左)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，确定在所指肿瘤中所有TAMs归一化的吞噬事件的频率。gydF4y2BangydF4y2Ba，对小鼠肿瘤样本进行TUNEL分析。凋亡细胞(绿色)染色(左)，定量(右)。gydF4y2Bao-qgydF4y2Ba“615”鼠尾静脉注射表达shControl或C3 shRNA、C5 shRNA的AAV8病毒4周后处死小鼠。收集切碎的小鼠肝组织。mrna的相对表达水平gydF4y2Ba(o)gydF4y2Ba蛋白质水平gydF4y2Ba(p)gydF4y2Ba的gydF4y2BaC3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaC5gydF4y2Ba分别采用qPCR和ELISA法检测。采集小鼠外周血，ELISA检测C3和C5蛋白水平gydF4y2Ba(问)gydF4y2Ba．gydF4y2Bac, h-qgydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BangydF4y2Ba= 9gydF4y2Ba(b, j, m)gydF4y2Ba或6gydF4y2Ba(c h k o-q)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba或10gydF4y2Ba(l, n)gydF4y2Ba老鼠。C1，克隆1;C2，克隆2。gydF4y2Ba
图10补体激活消除PD-1阻断抵抗。gydF4y2Ba
a、bgydF4y2Ba， H322M细胞中有无EGFR L858R表达gydF4y2BaLINC00973gydF4y2Ba将敲入TBE2突变体或CD55/CD59 shRNA表达皮下注射到恢复人体补体系统的人源NOG小鼠体内。这些小鼠分别用抗pd -1或抗cd55 /CD59抗体治疗或不治疗。gydF4y2Baa, egydF4y2Ba，在注射肿瘤细胞26天后测量肿瘤体积和重量。进行肿瘤体积纵向分析(左)。gydF4y2Bab, fgydF4y2Ba，采用Kaplan-Meier图分析小鼠存活率。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值计算使用agydF4y2Balog-rankgydF4y2Ba测试(两面)。gydF4y2BacgydF4y2Ba用Wnt-7B (200 ng/ml)和XAV939 (10 μM)分别处理或不加Wnt-7B (200 ng/ml) 12 h。相对表达量gydF4y2BaCD55gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCD59gydF4y2Ba用qPCR检测mrna。gydF4y2BadgydF4y2Ba分别用Wnt-7B (200 ng/ml)、XAV939 (10 μM)处理细胞24 h。使用指定抗体进行免疫印迹分析。gydF4y2Bae, fgydF4y2Ba， H1395细胞(4 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)皮下注射到恢复人体补体系统的人源化NOG小鼠体内。用抗pd -1抗体和/或XAV939处理或不处理这些小鼠。gydF4y2BaggydF4y2Ba， MC38细胞(2 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba分别将表达APC shRNA和含有或不含CD55和CD59 shRNA的APC shRNA皮下注射到C57Bl/6小鼠体内。用抗pd -1抗体治疗或不治疗这些小鼠。注射肿瘤细胞后20天测量肿瘤体积和重量。进行肿瘤体积纵向分析(左)。gydF4y2BahgydF4y2Ba， H1395细胞(4 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)皮下注射到恢复人体补体系统的人源化NOG小鼠体内。这些小鼠分别用抗pd -1抗体或抗cd55和抗cd59抗体治疗或不治疗。在注射肿瘤细胞26天后测量肿瘤体积和重量。进行肿瘤体积纵向分析(左)。gydF4y2BaI j kgydF4y2Ba表达EGFR L858R的H1395细胞gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)皮下注射到恢复人体补体系统的人源化NOG小鼠体内。小鼠在肿瘤形成后第11天给予灌胃药或吉非替尼(80 mg/kg)，每周5天。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，在注射肿瘤细胞26天后测量肿瘤体积和重量。进行肿瘤体积纵向分析(左)。gydF4y2Baj, kgydF4y2Ba,免疫印迹gydF4y2Ba(j)gydF4y2Ba和包含IHCgydF4y2Ba(k)gydF4y2Ba用所示抗体进行分析。具有代表性的免疫组化染色图像反映gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个产生相似结果的生物独立实验gydF4y2Ba(k)gydF4y2Ba．gydF4y2Bal-ngydF4y2Ba、人类非小细胞肺癌标本(gydF4y2BangydF4y2Ba= 200例)，分别用免疫组化法(IHC)和用LNA探针(ISH)检测LINC00973水平。gydF4y2BalgydF4y2Ba，显示代表性图像。图中所示红框区域被放大。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba．米gydF4y2Ba，采用双侧Pearson相关检验进行相关分析。Pearson相关系数。注意，一些样本的分数是重叠的。红色或蓝色的强度代表人类NSCLC标本的数量(红色或蓝色越深代表人类NSCLC标本的数量越多)。gydF4y2BangydF4y2Ba，显示了所示蛋白(左图)和LINC00973(右图)的代表性表达图像。以U6表达作为对照。红色框内的区域是在放大倍数下显示的。对指示蛋白和LINC00973的表达水平进行评分。gydF4y2BangydF4y2Ba= 200个肿瘤组织;gydF4y2BangydF4y2Ba= 200个正常组织(右侧)。gydF4y2BaA c e g h i ngydF4y2Ba，数据以均数±标准差表示。数据采用双侧未配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(右)gydF4y2Ba， c, egydF4y2Ba(右)gydF4y2BaggydF4y2Ba(右)gydF4y2BahgydF4y2Ba(右)gydF4y2Ba,我gydF4y2Ba(右)gydF4y2BangydF4y2Ba(右)gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba= 6gydF4y2Baa, e, g, h, i)gydF4y2Ba或10gydF4y2Ba(b, f)gydF4y2Ba或4gydF4y2Ba(c)gydF4y2Ba老鼠。C1，克隆1。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
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补充图1、图2和表1 - 11。gydF4y2Ba
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关于本文gydF4y2Ba
引用本文gydF4y2Ba
邵峰，高勇，王伟，王伟。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba沉默egfr上调表达的CD55和CD59激活补体系统，使肺癌对检查点封锁敏感。gydF4y2BaNat癌症gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba， 1192-1210(2022)。https://doi.org/10.1038/s43018-022-00444-4gydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s43018-022-00444-4gydF4y2Ba
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补充免疫疗法gydF4y2Ba
自然癌症gydF4y2Ba(2022)gydF4y2Ba
