生态学研究中的分子遗传技术与标记

生态学与生物的进化史密不可分。通过遗传修饰的下降过程，生物不断地将遗传信息从一代传递给下一代，这些信息随后被记录在后代的DNA中。分子生物学能够利用这些记录来更好地了解物种的起源和它们存在的生态基础，这已经成为现代生态学研究的基石。

在这篇文章中，我们简要地回顾了分子工具和方法，现代生态学家寻求更深入地了解物种形成、多样化和进化适应的遗传基础，因为它们与不断变化的复杂环境相互作用。

大多数基于分子的研究首先从特定生物体中提取DNA，然后使用聚合酶链式反应(PCR)对特定DNA片段进行扩增(即产生许多副本)(图1)。PCR的实用在于只需要极少量的DNA(例如，纳克量)。这在研究人员无法获得大量组织(例如稀有植物或动物物种)或需要大量样本(如群体遗传研究)时特别有用。例如，生态学家可能会问:在广泛的环境梯度中，由单一物种组成的种群在基因上的多样性如何?答案首先要从多个种群的不同个体中获取DNA，并将其用于基于pcr的遗传多样性调查。这样的调查可以导致对历史过程的推断，这些过程导致了跨越广泛的地理和环境条件的人群基因组成的差异。或者，人们可能想知道进化史和一组物种成员之间的关系。以达尔文的雀为例。(图2)。同样，PCR被用于扩增不同物种DNA的特定编码或非编码区域，最终目标是在复合体中重建每个物种的系统发育历史。一旦确定，该研究得出的系统发育树可以提供关于物种复合体多样性的信息，以及哪些物种彼此之间的亲缘关系最密切(图3)。反过来，这可以深入了解导致物种复合体多样性的生态(例如，生态位空间利用)和行为因素(例如，觅食)。

分子生态学中有许多不同类型的DNA标记，包括:微卫星(mats，高度重复的DNA序列，快速突变，通常用于识别个体)，小卫星(类似于微卫星，但具有更长的重复序列)，限制性片段长度多态性(RFLPs, DNA的特定位点，可以被酶切割，在不同物种，种群中产生不同大小的DNA片段，以及-很少-个体)和DNA序列数据(DNA的碱基被确定，相似性和差异性被比较，以识别物种、种群和个体)。这些方法生成的标记也以不同的方式显示出来。传统上，mats和RFLPs被琼脂糖凝胶电泳显示为离散带。然而，组成DNA序列的核苷酸需要更精细的分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶和放射自显影技术来实现。今天，这些标记类型通常使用化学荧光和遗传分析仪进行可视化，这些分析仪检测标记引物的荧光发射(如在mats的情况下)或DNA序列的荧光标记核苷酸。这些标记和可视化方法绝不是一个全面的列表，人们选择的技术在很大程度上取决于研究中要解决的问题的类型。通过了解不同的标记方法所提供的不同类型的信息，人们可以就哪种方法最适合特定的研究做出明智的决定。下面，我们将介绍分子生态学研究中常用的三种分子方法。

有三种不同类型的标记，可以根据它们提供的信息类型轻松区分。匿名标记包括由一种称为扩增片段长度多态性(AFLPs)的方法生成的标记(图4)。该技术使用限制性内切酶与PCR结合，生成数千个独特的片段，可用于同一属内或同一属内种间个体的遗传指纹。AFLP方法的实用性在于它不需要对生物体基因组的先验知识。换句话说，这种方法所针对的基因组区域对于研究者来说是未知的(因此，“匿名”)。然而，这种方法通常提供了关于遗传多样性和分化基本水平的丰富信息来源。因此，AFLP标记通常被用作调查种群或物种差异的第一步。然而，使用aflp的缺点是，它们所能提供的信息类型在某种程度上受到限制。例如，由于这些标记的来源和核苷酸组成未知(即，它们只是在基因组中构成不同长度的片段)，它们在重建一组生物的进化史方面的作用有限。此外，AFLP标记通常被称为显性标记，并被分为“存在”或“不存在”，这意味着通常不可能确定凝胶上的条带是否代表纯合(AA)或杂合(AA)基因型。这是因为AFLP片段代表了每个个体中存在或不存在的唯一限制位点，因此只有一个等位基因(如果存在)被扩增，从而限制了可以获得的信息量。 Another similar method called random amplified polymorphic DNA (RAPD) also generates dominant markers, which are typically viewed using agarose gel electrophoresis. This method, however, has largely been replaced by the AFLP method, which typically uses chemifluorescence and a genetic analyzer for visualization.

另一类标记，称为序列标记位点(STS)标记，提供了一种表征物种内部和物种之间遗传多样性的替代方法。序列标记位点是一段短的核苷酸序列(200-500 bp)，在基因组中具有独特的位置，并使用研究人员设计的引物进行PCR靶向。一种类型的STS标记由微卫星(msat)表示，也称为简单序列重复序列(SSRs)或可变数量串联重复序列(VNTRs)。与aflp不同，这些标记确实需要一些包含串联重复核苷酸基序的特定区域的知识，如“ATC”或“GAG”，它们通常出现在DNA的非编码区域。结合专门针对这些位点设计的引物，并通过PCR进行扩增，STS方法在个体之间提供了更精细的区分。作为共显性标记，它们能够揭示个体是否在特定位点杂合(例如Aa vs . Aa)，因为两个等位基因(a和a)在PCR过程中都被扩增。鉴于它们的确切核苷酸组成(例如，每个重复是否总是“ATC”)并不总是已知的，这些标记在系统发育重建方面与aflp具有相同的局限性，因为标记的同源性尚不清楚。扩展STS标记其确切核苷酸组成未知的效用的一种方法是对来自多态位点的片段进行测序。一种被称为序列特征扩增区(scar)的标记方法使用已克隆和测序的片段来确定其确切的核苷酸组成。一旦测序成功，就可以围绕SCAR设计引物，然后重新扩增以寻找琼脂糖凝胶上的片段长度多态性。 Interestingly, this method is often used in combination with anonymous, dominant markers such as AFLPs and RAPDs, thereby also extending their utility.

分子生态学家有时使用的另一种非pcr标记方法是等位酶分析。这些标记来自于编码重要代谢过程(如糖酵解)中使用的酶的位点。尽管它们不像STS标记那样快速进化，但它们通常会产生中等至高水平的遗传变异，这取决于生物体。在任何一种情况下，来自STS或等位酶标记的信息都可以用来确定种群内的杂合度是否与某些生态变量相关。例如，可以研究与植物的生长速度和性能或动物对环境变化的适应性反应相关的杂合度水平。

分子生态学家经常使用的第三类标记是那些来自基因组中目标区域的直接DNA测序的标记。这些通常被称为Sanger测序(图5)。与STS标记一样，DNA测序需要研究者感兴趣的特定基因或基因区域的精确知识。结合PCR和精心设计的引物，这种方法为分子生态学家提供了目前最精细和最基本的遗传细节。这是因为精确的核苷酸序列可以用于广泛的分类水平的交叉比较分析，从门到种，甚至根据变异水平，在种群内的个体之间也可以获得。因此，DNA测序对于确定一组生物的进化史和推断进化过程和模式是理想的，例如适应性性状位点的遗传基础(例如，植物对日长反应的基因)，动物物种迁移和扩张的历史模式(例如，从更新世到今天)，以及分类学多样化所涉及的特定性状的进化(例如，脊索的起源导致脊椎动物)-仅举几个例子。分子生态学家在研究动物系统发育时广泛使用的一个特别有用的基因组是线粒体DNA (mtDNA)的细胞器基因组。mtDNA的一个区域已被证明在低分类学水平(即物种水平)特别有用，即细胞色素氧化酶I (COI)区域，也被称为“条形码”区域，因为它能够使用通用引物和不同物种的遗传条形码组。植物分子生态学家经常使用的另一个基因组是叶绿体基因组，它已被广泛用于跟踪植物迁移的历史模式和重建植物系统发育。

DNA测序也使另一种高度多态的共显性标记类型的发展成为单核苷酸多态性(SNPs)。当为一个物种中的多个成员生成特定区域的多个序列时，通常会检测到个体之间的单碱基差异。取决于DNA测序水平(例如，单个区域vs .全基因组)，snp可以提供广泛的基因组覆盖，显示高水平的变异性，并可用于系统发育重建，因为这些标记的同源性是已知的。

另一种不同但相关的针对单个基因区域的方法是全基因组测序。最近开发的一种快速生成可分析并编译成整个基因组的短序列片段的方法被称为下一代测序。虽然通常局限于具有小基因组的生物(例如，细菌或病毒)，但下一代测序正成为感兴趣的分子生态学家的重要工具，他们对探测整个基因组以寻找生态学问题的线索感兴趣。

考虑到不同分子遗传技术的优缺点，人们可能想知道如何最好地设计一个实验来回答一个特定的生态问题。这一课题需要仔细考虑标记方法和标记信息内容。

在使用基因技术时要问的一个关键问题是:哪一个最适合我的特定问题?这个问题的答案将由几个因素决定，所有这些因素都必须单独和共同进行评估，以便得出一个成功的分子生态学研究的有凝聚力的计划。图6显示了一个流程图，用于初步考虑哪种(或几种)方法最适合您的特定问题。虽然有许多不同的方法来处理这个问题，一个简单的策略是从分类学层面的调查开始。

你对种群水平的物种差异感兴趣吗?匿名标记是您感兴趣的生物唯一可用的标记吗?如果是这样，那么aflp可能是选择的标记物。

你需要知道诸如观察到的或预期的杂合度等细节吗?或者，你是否试图将中性标记变异(即那些没有被选择的标记)与一些环境变量联系起来?在这种情况下，aflp可能有用，但STS或等位酶标记可能是更好的方法。

你对重建一群生物的进化史感兴趣吗?如果是这样，你的问题是针对哪个层次的探究:在属内的种之间，属之间，还是在更高的分类学层次上(例如，科，甚至门)?取决于你想要靶向的区域(例如，编码DNA vs .非编码DNA，核mtDNA vs .细胞器mtDNA)，来自DNA测序的同源标记可能会提供最大的收益。

你对基因组进化感兴趣吗?例如，你可能有兴趣了解致病性细菌和非致病性细菌的基因组有何不同，以及与病原体相关基因的毒性是否存在生态或环境相关性。

在这种情况下，全基因组测序(不仅仅是单个基因区域)现在是可行的，可以很容易地用于分析小基因组，将为感兴趣的问题提供丰富的信息来源。

尽管有多种方法来评估哪个标记最适合哪个问题，但仔细考虑你需要的遗传变异水平以及在哪个分类水平上选择最佳方法是至关重要的。理解这个非常简单的策略，并仔细地应用它，最终可以决定你的问题在分子生态学领域的回答和发表的程度。